Nrf2在肺纖維化治療中作用的研究進(jìn)展

陳 雁 王玉敏

(赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，內(nèi)蒙 赤峰 024005)

肺纖維化(PF)是一種慢性、進(jìn)展性、不可逆轉(zhuǎn)的肺部疾病，臨床表現(xiàn)為逐漸加重的呼吸困難，患者最終因肺功能嚴(yán)重受損發(fā)生呼吸衰竭而死亡。目前還沒有方法可以完全阻斷PF的發(fā)生。PF的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，最近研究〔1〕顯示氧化應(yīng)激反應(yīng)參與PF發(fā)病機(jī)制，因此，抑制氧化應(yīng)激導(dǎo)致的肺損傷已成為防治PF的新策略。本文總結(jié)了肺部發(fā)生纖維化過程中氧化應(yīng)激損傷的來源及其在PF形成中的作用，并對以轉(zhuǎn)錄因子(Nrf2)抗氧化通路為靶點(diǎn)治療PF的進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)。

1 PF過程中氧化應(yīng)激來源

氧化應(yīng)激(oxidative stress)是指活性氧產(chǎn)生增多和/或抗氧化防御耗竭產(chǎn)生的一系列分子、細(xì)胞和組織的功能損害〔1〕。與機(jī)體其他器官相比，肺暴露于高水平的氧，使其更容易受到氧化應(yīng)激的攻擊從而產(chǎn)生損害，吸入的空氣中氧的壓力達(dá)到150 mmHg，而肺泡氣氧的壓力可達(dá)到100 mmHg。PF過程中氧化應(yīng)激來源主要包括線粒體、還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶和抗氧化防御體系酶的耗竭。

1.1線粒體介導(dǎo)產(chǎn)生活性氧(ROS) 線粒體產(chǎn)生ROS是介導(dǎo)PF產(chǎn)生的主要參與因素。線粒體功能障礙主要產(chǎn)生包括過氧化氫(H2O2)和超氧負(fù)離子(O2·-)在內(nèi)的活性氧簇〔2〕。線粒體電子傳遞鏈(ETC) 是細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要途徑。ETC是O2·-的主要產(chǎn)生來源。大約2%的線粒體氧耗轉(zhuǎn)變成O2·-。ETC是生物體三磷酸腺苷(ATP)能量的來源，在能量傳遞的過程中，一小部分電子發(fā)生泄漏，泄漏的電子被O2接收即生成O2·-。其中復(fù)合體Ⅰ和復(fù)合體Ⅳ產(chǎn)生ROS的能力較強(qiáng)。研究顯示，肺泡巨噬細(xì)胞(AM)線粒體介導(dǎo)產(chǎn)生的H2O2在引起石棉沉滯癥中的作用〔3〕，AM暴露于石棉樣纖維(asbestos fibers)后可誘導(dǎo)H2O2的產(chǎn)生，而這一作用可被氧化氫酶(CAT)阻斷，AM線粒體應(yīng)激水平減弱。另外，Rho結(jié)合蛋白家族成員Rac1增加AM線粒體H2O2的產(chǎn)生，而敲低ETC復(fù)合體Ⅲ的ROS產(chǎn)生位點(diǎn)鐵硫蛋白能夠減弱石棉誘導(dǎo)的AM H2O2的產(chǎn)生。石棉沉滯癥患者AM線粒體Rac1的表達(dá)水平升高，而條件性刪除Rac1基因的小鼠肺內(nèi)氧化應(yīng)激水平較低和PF發(fā)生程度減輕?？傊弈軌蛲ㄟ^將電子由復(fù)合體Ⅲ轉(zhuǎn)移給Rac1從而促進(jìn)AM H2O2的產(chǎn)生，觸發(fā)一系列下游事件，導(dǎo)致石棉沉滯癥的發(fā)生。因此，推斷Rac1可以作為PF的一個新的分子標(biāo)志物。H2O2參與PF發(fā)生的另一項證據(jù)來源于CAT能夠減弱石棉沉滯癥嚙齒類動物模型PF的發(fā)生〔4〕。另外，一些外源性毒素，如石棉樣纖維能夠激活參與PF發(fā)生的非內(nèi)皮細(xì)胞線粒體ROS的產(chǎn)生〔5〕。

1.2NADPH氧化酶 NADPH氧化酶在肺內(nèi)ROS的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。NADPH氧化酶是一個與細(xì)胞膜結(jié)合的、含有多亞基的酶復(fù)合體，其主要功能是實現(xiàn)電子從NADPH跨細(xì)胞膜傳遞給分子氧，產(chǎn)生O2·-及其下游的ROS。NADPH氧化酶家族由NOX2，NOX1,NOX3,NOX4,NOX5,DUOX1和DUOX2 NADPH氧化酶7個成員組成，每個成員通過與細(xì)胞膜結(jié)合的催化亞基“Nox”或“Duox” 的不同進(jìn)行區(qū)別。NADPH氧化酶催化亞基gp91phox/NOX2及其6個同源物統(tǒng)稱為NOX家族蛋白。這些NOX家族蛋白在不同組織中具有獨(dú)特的表達(dá)分布。當(dāng)細(xì)胞受到刺激后4個細(xì)胞質(zhì)成分募集到細(xì)胞膜上，與兩個膜結(jié)合的成分組成有活性的NADPH氧化酶復(fù)合體，促進(jìn)ROS的產(chǎn)生〔6〕。NADPH 氧化酶的主要功能是產(chǎn)生O2·和H2O2產(chǎn)生，從而參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、殺死外來微生物的侵入等〔7〕。

最近研究顯示NADPH氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS在PF過程中發(fā)揮重要作用，尤其是NOX1,NOX2,NOX4-NADPH氧化酶參與PF發(fā)病機(jī)制〔7〕。轉(zhuǎn)化生長因子-(TGF)-β誘導(dǎo)激活NOX4-NADPH 氧化酶，從而通過促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞分化和上皮再形成。TGF-β和氧化應(yīng)激共同促進(jìn)PF形成〔8〕。TGF-β是最強(qiáng)效促纖維化細(xì)胞因子，通過調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、黏附、遷移、凋亡及上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型(EMT)，進(jìn)而在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積的過程中發(fā)揮重要作用。研究顯示，NOX4-NADPH氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生的H2O2對于TGF-β誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞分化和ECM產(chǎn)生是必須的，NOX4基因敲除或藥理學(xué)途徑抑制NOX4可以阻止博來霉素誘導(dǎo)的小鼠PF的發(fā)生〔9〕。同時博來霉素能夠誘導(dǎo)小鼠肺內(nèi)NOX4的表達(dá)升高，PF患者肺內(nèi)NOX4的表達(dá)也是升高的〔9〕。TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞分化與細(xì)胞外H2O2的產(chǎn)生相關(guān)，后者促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞(AEC)死亡。AEC死亡是PF的重要始動事件和PF持續(xù)存在的主要事件〔10〕。NOX4在PF患者增生的肺泡上皮中強(qiáng)效表達(dá)，尤其在2型肺泡細(xì)胞(AT2)中表達(dá)明顯〔10〕。NOX4基因缺失，可阻止博來霉素誘導(dǎo)的小鼠AT2細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔11〕。NOX-4化學(xué)性抑制劑處理來源于NOX4基因缺失的內(nèi)皮細(xì)胞或AEC，能夠降低TGF-β1介導(dǎo)的ROS產(chǎn)生和AEC凋亡。綜上所述，NOX4-NADPH氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS參與AEC凋亡機(jī)制，進(jìn)而促進(jìn)PF發(fā)生。

NOX2-NADPH氧化酶同時也參與PF的發(fā)生。最近研究發(fā)現(xiàn)，NOX2基因缺失的小鼠，能夠阻止博來霉素誘導(dǎo)的小鼠PF的發(fā)生〔7〕。

1.3抗氧化防御體系酶的耗竭 肺本身表達(dá)一些抗氧化酶，從而保護(hù)肺臟因氧化應(yīng)激引起損傷?？寡趸烙w系的酶的缺失能夠促進(jìn)氧化應(yīng)激的發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)PF的發(fā)生。

1.3.1CAT CAT可促使H2O2分解為分子氧和水(2 H2O2→2 H2O+O2)，清除體內(nèi)的過氧化氫，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。CAT 是AEC和炎癥細(xì)胞內(nèi)H2O2的清除劑，能夠抑制H2O2介導(dǎo)的PF患者肺內(nèi)成纖維細(xì)胞的活化〔12〕。持續(xù)靜脈滴注聚乙二醇-過氧化氫酶能夠阻止大鼠石棉沉滯癥誘導(dǎo)的PF發(fā)生。

1.3.2谷胱甘肽(GSH) GSH是正常肺內(nèi)的小分子抗氧化劑，PF患者肺內(nèi)GSH含量減低。谷胱甘肽前體N-乙酰半胱氨酸(NAC)可以增加PF動物模型肺內(nèi)的GSH水平，減弱博來霉素誘導(dǎo)的PF的發(fā)生。霧化吸入NAC，能夠增強(qiáng)PF患者抗氧化/氧化平衡體系。一項3期臨床實驗表明，NAC顯示出對PF的潛在治療價值〔11〕。

2 Nrf2與PF的治療

2.1Nrf2與PF 機(jī)體細(xì)胞本身具有一套復(fù)雜的抗氧化系統(tǒng)，此系統(tǒng)組成Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)-抗氧化酶通路。生理狀態(tài)下，在胞質(zhì)內(nèi)的Nrf2與細(xì)胞骨架相關(guān)性抑制蛋白(Keap1)結(jié)合形成一個復(fù)合體，使Nrf2經(jīng)泛素蛋白酶途徑降解。當(dāng)細(xì)胞或機(jī)體暴露于ROS時，引起Keap1的修飾，從而使Keap1募集Nrf2的功能發(fā)生改變，Keap1-Nrf2復(fù)合體解離，Nrf2從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，與受其調(diào)控的抗氧化酶基因的ARE結(jié)合，從而啟動編碼解毒和抗氧化的基因表達(dá)，使其表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞存活等功能。見圖1。

圖1 Nrf2抗氧化系統(tǒng)

Nrf2在調(diào)節(jié)PF過程中的作用引起研究者的關(guān)注。Cho等〔11〕是最早研究Nrf2在PF中的作用，研究顯示，Nrf2基因敲除(Nrf2-/-)的小鼠中，博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺損傷和內(nèi)皮細(xì)胞死亡較野生型小鼠(Nrf2+/+)加重。而反應(yīng)PF化的指數(shù)，即羥脯氨酸含量、膠原沉積、纖維化評分，細(xì)胞增殖程度，Nrf2基因敲除(Nrf2-/-)的小鼠較野生型小鼠(Nrf2+/+)水平高。博來霉素誘導(dǎo)野生型小鼠(Nrf2+/+)Nrf2的表達(dá)和活性升高。博來霉素可以在野生型小鼠(Nrf2+/+)上調(diào)一些受Nrf2調(diào)控的細(xì)胞保護(hù)蛋白的表達(dá)。同時，與Nrf2基因敲除(Nrf2-/-)的小鼠比較，在野生型小鼠(Nrf2+/+)博來霉素誘導(dǎo)的反應(yīng)肺損傷和PF的標(biāo)志物的蛋白水平較低。綜上研究表明，Nrf2在PF的發(fā)生發(fā)展過程中起到抑制PF發(fā)生的保護(hù)作用，這一保護(hù)作用通過上調(diào)特定細(xì)胞保護(hù)蛋白實現(xiàn)。因此，Nrf2成為治療PF的新的潛在靶點(diǎn)。最近的一些研究，進(jìn)一步證實了這一推斷，在Nrf2基因敲除(Nrf2-/-)的小鼠中對博來霉素和百草枯(paraquat，PQ)誘導(dǎo)的PF發(fā)生更加敏感〔13〕。博來霉素可以通過調(diào)控ERK1/2進(jìn)而抑制Nrf2活性，從而促進(jìn)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生和PF的發(fā)生〔14〕。

2.2激活Nrf2在PF中的保護(hù)作用 激活Nrf2抗氧化通路在PF中具有保護(hù)作用，使其成為治療PF的新靶點(diǎn)。以Nrf2抗氧化通路為靶點(diǎn)治療PF方面，研究者做了有益的探索，取得了一些進(jìn)展。

2.2.1抑制博來霉素誘導(dǎo)的PF發(fā)生 Sriram等〔15〕較早提供了調(diào)控Nrf2在PF中具有保護(hù)作用的研究證據(jù)，研究顯示，表沒食子兒茶素(EGCG) 可以抑制博來霉素誘導(dǎo)的PF發(fā)生，博來霉素可誘導(dǎo)大鼠肺內(nèi)ROS產(chǎn)生、脂質(zhì)過氧化作用、羥脯氨酸和髓過氧化物酶的活性增加，EGCG可以減弱這一作用，并恢復(fù)博來霉素引起的抗氧化狀態(tài)。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，博來霉素可導(dǎo)致大鼠肺炎癥反應(yīng)增加和肺泡損傷，而EGCG可以降低博來霉素引起的膠原沉積。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，EGCG能夠上調(diào)博來霉素引起的細(xì)胞保護(hù)酶基因的表達(dá)降低，即上調(diào)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和依賴還原型輔酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化還原酶 1(NQO1)的表達(dá)。同時研究顯示EGCG是Nrf2的激活劑。綜上所述，EGCG通過激活Nrf2，進(jìn)而促進(jìn)GST和NQO1的表達(dá)來抑制博來霉素引起的PF發(fā)生。植物源性多酚類黃酮類抗氧化劑槲皮素能夠通過激活Nrf2，進(jìn)而上調(diào)血紅素加氧酶(HO)-1的表達(dá)來抑制TGF-β誘導(dǎo)的膠原蛋白的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制PF的發(fā)生〔16〕。在雄性Wistar大鼠，黃連素能夠抑制博來霉素引起的肥大細(xì)胞沉積和組胺的釋放，并通過激活Nrf2來增加肺內(nèi)抗氧化狀態(tài)，抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB依賴的TGF-β通路激活，進(jìn)而抑制PF的發(fā)生〔17〕。另外最近的研究顯示，葫蘆巴種子提取物苷〔18〕、丹酚酸〔19〕、南蛇藤醇〔20〕、利拉利汀〔21〕、 中華獼猴桃果仁非飽和脂肪酸〔22〕、苦參堿〔23〕、蘿卜硫素〔24〕、廣譜抗纖維化作用藥物吡非尼酮(PFD)〔25〕均能夠不同程度激活Nrf2通路，上調(diào)細(xì)胞保護(hù)蛋白的表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生，進(jìn)而抑制博來霉素引起的PF發(fā)生。

2.2.2抑制百草枯誘導(dǎo)的PF發(fā)生 諾奧奶薊草提取物復(fù)合膠囊能夠在SD大鼠和A549細(xì)胞中通過激活Nrf2，進(jìn)而促進(jìn)HO-1和NQO1的表達(dá)，減弱炎癥和氧化應(yīng)激發(fā)生，從而抑制PQ引起的PF發(fā)生〔26〕。研究顯示葛根素可以抑制PQ誘導(dǎo)的小鼠PF的發(fā)生，進(jìn)一步研究表明，葛根素能夠通過激活Nrf2，進(jìn)而阻斷Fstl 1通路、TGF-β1通路和氧化應(yīng)激發(fā)生進(jìn)而抑制PF的發(fā)生〔27〕。最近研究表明，丹酚酸B能夠同過激活Nrf2，降低NOX4-NADPH 氧化酶水平，從而減弱PQ引起的小鼠肺內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生，并抑制TGF-β1的表達(dá)及其下游蛋白Smad3的磷酸化，最終抑制PQ引起的小鼠PF發(fā)生〔28〕。雷怕霉素同樣也能夠通過激活Nrf2通路抑制PQ引起的PF發(fā)生〔29〕。治療瘧疾急性發(fā)作的氯喹同樣也可經(jīng)過Nrf2通路的激活，上調(diào)HO-1和NQO1的表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生，從而能抑制PQ引起的PF發(fā)生〔30〕。綜上所述，激活Nrf2通路了，能夠抑制百草枯誘導(dǎo)的PF發(fā)生。

2.2.3抑制硅誘導(dǎo)的PF發(fā)生 硅肺病是世界范圍內(nèi)最常見的職業(yè)性肺疾病。二氧化硅(SiO2)能夠通過誘導(dǎo)大鼠肺內(nèi)ROS和丙二醛(MDA)產(chǎn)生增加，激活Nrf2及其下游硫氧還蛋白(Trx)。硅抑制Trx活性并下調(diào)硫氧還蛋白還原酶(TrxR)的表達(dá)，表明硅抑制Trx系統(tǒng)。所以硅通過抑制Trx系統(tǒng)，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激發(fā)生，進(jìn)而誘導(dǎo)大鼠肺PF的發(fā)生〔31〕。

最近研究顯示，蚯蚓提取物能夠通過激活Nrf2依賴的機(jī)制抑制二氧化硅誘導(dǎo)的小鼠肺PF的發(fā)生〔32〕。蚯蚓提取物可以抑制二氧化硅引起的氧化應(yīng)激、線粒體依賴的凋亡發(fā)生和上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換(EMT)。因此，蚯蚓提取物是潛在的通過激活Nrf2而在PF治療具有前景的藥物。

2.2.4抑制煙氣誘導(dǎo)的PF發(fā)生 最近研究顯示，硫化氫(H2S)能夠通過激活Nrf2，進(jìn)而上調(diào)HO-1和硫氧還蛋白(Trx)-1的表達(dá)來抑制慢性煙氣暴露氧化應(yīng)激的發(fā)生和炎癥的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制大鼠肺PF的發(fā)生〔33〕。H2S能夠減少慢性煙氣暴露大鼠肺內(nèi)氧化應(yīng)激水平，減少超敏C反應(yīng)蛋白、TNF-α、IL-1β和IL-6。

3 問題與展望

目前研究表明，Nrf2在抑制肺纖維化過程中具有保護(hù)作用，但Nrf2依賴的下游效應(yīng)因子與PF之間的相互作用仍闡釋不清。Nrf2及受其調(diào)控蛋白在PF中作用的進(jìn)一步闡明,對以Nrf2為靶點(diǎn)篩選治療PF的藥物至關(guān)重要，對于PF的預(yù)防和治療具有深遠(yuǎn)意義。

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