雷帕霉素對(duì)氧化應(yīng)激引起脊髓損傷的作用及機(jī)制

宋 宇 劉冬麗 趙金武 陳 慧 劉佳梅

(長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 長(zhǎng)春 130031)

脊髓損傷是一種臨床上常見的、不可恢復(fù)性的、致殘性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，目前尚無有效治療方法〔1〕。脊髓損傷的病理機(jī)制與活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生緊密相關(guān)，ROS通過破壞細(xì)胞膜、氧化細(xì)胞的蛋白質(zhì)和DNA殺傷細(xì)胞〔2〕，氧化應(yīng)激損傷被認(rèn)為是脊髓二次損傷的病理特點(diǎn)。ROS的體內(nèi)代謝種類繁多，過氧化氫(H2O2)是其中一種，由于其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，成為氧化應(yīng)激細(xì)胞模型中最常用的藥物。我們利用H2O2作用PC12細(xì)胞成功建立氧化應(yīng)激損傷模型，復(fù)制脊髓損傷后神經(jīng)元的二次損傷病理過程。雷帕霉素(Rap)是成熟的藥物，有文獻(xiàn)報(bào)道其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，它抑制mTOR信號(hào)通路，通過上調(diào)自噬水平、抵抗凋亡途徑，起到神經(jīng)保護(hù)作用〔3，4〕；目前在脊髓損傷疾病中作用尚不明確。本文研究Rap對(duì)氧化應(yīng)激引起脊髓損傷的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑及細(xì)胞 DMEM培養(yǎng)基購于Gibco公司；胎牛血清(FBS)購于Gibco公司；馬血清購于Hyclone公司；Hoechst33342染色劑購于江蘇碧云天生物有限公司；兔抗大鼠LC3-Ⅱ多克隆抗體購于Abcam公司；Rap(553211) 購于Merck公司；MDC(D4008)購于美國(guó)Sigma公司；DCFH-DA(D6883)購于美國(guó)Sigma公司。上海細(xì)胞庫購買PC12細(xì)胞。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1PC12細(xì)胞的培養(yǎng) 利用5%馬血清和10%FBS加鏈霉素 100 mg/L、青霉素 100 U/L的DMEM培養(yǎng)液調(diào)制成PC12細(xì)胞的培養(yǎng)液。5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，隔2 d細(xì)胞換液，隔4 d細(xì)胞分瓶。

1.2.2氧化應(yīng)激損傷模型的建立 在37℃、5%CO2條件下，將PC12細(xì)胞在胰酶處理后接種于96孔板，密度是每孔5×103，10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)達(dá)到每孔80%的密度。加H2O2引起PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，應(yīng)用MTT法檢測(cè)不同濃度H2O2作用不同時(shí)間的細(xì)胞存活率變化，獲得有效作用濃度。取H2O2100，200，400和800 μmol/L的不同濃度，作用12 h和24 h后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3Rap作用PC12細(xì)胞活力的測(cè)定 在37℃、5%CO2條件下，將PC12細(xì)胞在胰酶處理后接種于96孔板，每孔200 μl，密度是每孔5×103，培養(yǎng)至PC12細(xì)胞完全貼壁后進(jìn)行分組：PC12組(正常組)；PC12+H2O2組(損傷組)；PC12+ H2O2+Rap組(Rap組)。預(yù)先用Rap作用PC12細(xì)胞30 min和2 h，然后加H2O2作用PC12細(xì)胞24 h，最后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力的變化。檢測(cè)Rap預(yù)作用后，不同時(shí)間點(diǎn)PC12細(xì)胞氧化損傷的變化。

1.2.4MTT法檢測(cè) 100 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中溶解0.5 g MTT，4℃避光存放。單孔滴加20 μl MTT，培養(yǎng)3 h。波長(zhǎng)570 nm處酶標(biāo)儀讀取OD數(shù)值。獲得數(shù)據(jù)后，匯總統(tǒng)計(jì)，比較各孔細(xì)胞活力。

1.2.5MDC法染色 將1.2.3中各組細(xì)胞去除培養(yǎng)基，清洗3次；MDC溶于DMSO配成50 μmol/L濃度，單孔滴加200 μl，共育10 min；清洗3次，10%多聚甲醛固定30 min，清洗3次，封片劑防淬滅制片；355 nm波長(zhǎng)熒光顯微鏡觀察，熒光顆粒代表細(xì)胞內(nèi)自噬泡。在各組細(xì)胞內(nèi)隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照統(tǒng)計(jì)。

1.2.6Western印跡檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的變化 PC12細(xì)胞懸液接種于6孔板，密度是每孔5×105，按1.2.3實(shí)驗(yàn)步驟分組，并制備H2O2損傷模型；Rap預(yù)先處理細(xì)胞，然后提取各組細(xì)胞內(nèi)蛋白；自噬相關(guān)抗體LC3-Ⅱ(1∶500)作為一抗檢測(cè)蛋白，用Quantity one軟件分析LC3-Ⅱ表達(dá)。

1.2.7ROS生成的檢測(cè) 使用無血清培養(yǎng)液將DCFH-DA熒光染料稀釋至10 μmol/L，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的變化。按1.2.3實(shí)驗(yàn)步驟分組；每孔加入DCFH-DA 200 μl，共育60 min；無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3次；488 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，檢測(cè)DCF熒光強(qiáng)度，鏡下選取合適視野拍照；利用Image J軟件對(duì)熒光圖片進(jìn)行光密度檢測(cè)，分析匯總各組熒光強(qiáng)度間接反映PC12細(xì)胞活性氧變化。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1H2O2作用PC12細(xì)胞活力改變 100，200，400和800 μmol/L的H2O2與PC12 細(xì)胞分別作用12 h和24 h，H2O2濃度是100 μmol/L時(shí)細(xì)胞活力沒有明顯變化；當(dāng)H2O2濃度是200 μmol/L時(shí)，作用12 h細(xì)胞活力下降，作用24 h細(xì)胞活力下降更加明顯；當(dāng)H2O2濃度是400 μmol/L時(shí)，作用12 h和24 h細(xì)胞活力下降差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；當(dāng)H2O2濃度是800 μmol/L時(shí)，作用12 h與400 μmol/L濃度時(shí)細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。綜合分析，選取H2O2的濃度是200 μmol/L、作用時(shí)間是24 h作為細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的前提條件，建成細(xì)胞損傷模型。

2.2Rap預(yù)處理PC12細(xì)胞活力的變化 損傷組與正常組比較，細(xì)胞存活率為71%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Rap組與損傷組比較，Rap預(yù)先處理30 min細(xì)胞存活率是72%，預(yù)先處理2 h細(xì)胞存活率是81%；Rap預(yù)處理30 min細(xì)胞活力與PC12+H2O2組接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Rap預(yù)處理2 h細(xì)胞活力有明顯改善，與PC12+H2O2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。Rap預(yù)處理2 h作為有效的細(xì)胞作用時(shí)間。

2.33組細(xì)胞內(nèi)MDC染色觀察 正常組細(xì)胞內(nèi)自噬泡顆粒數(shù)量較少；損傷組細(xì)胞自噬泡顆粒數(shù)量較多；Rap組細(xì)胞自噬泡顆粒數(shù)量明顯增多，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，Rap明顯增加了細(xì)胞內(nèi)的自噬活性，見圖1。

表1 不同濃度、時(shí)間H2O2對(duì)PC12細(xì)胞活力的變化

與正常組比較：1)P<0.01

表2 Rap預(yù)處理PC12細(xì)胞活力的變化

與正常組比較：1)P<0.01；與損傷組比較：2)P<0.05

圖1 各組細(xì)胞內(nèi)MDC的染色觀察(×400)

2.4Western印跡法觀察各組細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ的變化 與正常組(1.00±0.00)比較，損傷組自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)(1.57±0.02)明顯增加(P<0.01)，提示氧化損傷時(shí)細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)，Rap組與損傷組比較LC3-Ⅱ高表達(dá)(2.21±0.05)，證實(shí)Rap預(yù)處理后，細(xì)胞自噬途徑上調(diào)更加明顯，強(qiáng)于氧化應(yīng)激損傷時(shí)的自噬活性，見圖2。

2.5各組細(xì)胞內(nèi)ROS的變化 正常組ROS的含量較低，提示正常細(xì)胞內(nèi)只有少量的活性氧代謝，損傷組(1.00±0.12)與正常組(8.98±0.78)比較，ROS的平均熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P<0.01)。Rap組(3.26±0.54)與損傷組比較，ROS的平均熒光強(qiáng)度明顯減少(P<0.01)，ROS含量明顯減少。提示氧化應(yīng)激損傷時(shí)ROS的生成最多，Rap預(yù)處理后可以減少ROS的產(chǎn)生，見圖3。

圖2 各組細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ的表達(dá)變化

圖3 各組細(xì)胞內(nèi)ROS的變化(×200)

3 討 論

本文MTT結(jié)果證實(shí)Rap具有細(xì)胞保護(hù)作用，這與前期大鼠脊髓損傷的動(dòng)物模型結(jié)果相一致〔5〕。細(xì)胞內(nèi)自噬泡形成過程中，先形成LC3-Ⅰ，后酶解成LC3-Ⅱ，最后在自噬體膜上結(jié)合形成自噬體，本文結(jié)果證實(shí)，細(xì)胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，自噬活性上調(diào)，Rap起到了自噬激活劑的作用。本文部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷〔6，7〕、脊髓損傷的文獻(xiàn)報(bào)道相一致〔8〕。在細(xì)胞自噬研究中，有文獻(xiàn)報(bào)道線粒體位置與ROS染色區(qū)域高度重疊〔9〕，也有文獻(xiàn)證實(shí)ROS大量產(chǎn)生于線粒體〔10〕。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)線粒體會(huì)有大量損傷，雖然此時(shí)自噬活性上調(diào)，但也不能吞噬損傷的全部線粒體，部分損傷的線粒體會(huì)排放出大量的ROS，后者則通過破壞細(xì)胞膜、氧化細(xì)胞的蛋白質(zhì)和DNA殺傷細(xì)胞。本文結(jié)果證實(shí)，H2O2損傷組PC12細(xì)胞，ROS大量產(chǎn)生，發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，認(rèn)為這是細(xì)胞死亡的主要原因。Rap使ROS水平下調(diào)，減小了氧化應(yīng)激損傷。有文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞通過自噬活動(dòng)吞噬受損的線粒體，清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧〔11〕。據(jù)此推算，Rap通過上調(diào)自噬活性，增強(qiáng)了清除受損線粒體的能力，繼而減少線粒體破壞后ROS的釋放，減少細(xì)胞內(nèi)毒性物質(zhì)的釋放，提高了細(xì)胞存活率。

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