microRNA-107在阿爾茨海默病患者血清中的表達(dá)及臨床意義

曾慶宏 劉 霞 莊愛(ài)霞 周 芳 于善花 姜建東 王傳淇 彭艷艷 張浩江 聶紅霞

(連云港市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 連云港 222006)

阿爾茨海默病(AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，表現(xiàn)為認(rèn)知、語(yǔ)言、記憶等功能障礙〔1～3〕，是導(dǎo)致老年人癡呆的主要原因〔4〕。近年來(lái)一些新技術(shù)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，促進(jìn)了蛋白組學(xué)的研究，基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF MSS)〔5〕,高效液相色譜與電感耦合等離子質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)〔6〕，液相色譜-紫外光譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLCUV-MS)〔7，8〕,鳥(niǎo)槍法蛋白質(zhì)組學(xué)〔9〕等對(duì)蛋白的分離、定性和定量的檢測(cè)，可能有助于新的AD生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)，但仍缺乏特異性和敏感性均高的單一的診斷方法。microRNA是真核生物中一類(lèi)長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的單鏈非編碼小分子RNA，主要功能是通過(guò)抑制靶mRNA翻譯或促使其降解的方式對(duì)基因表達(dá)起調(diào)控作用〔10〕，參與細(xì)胞周期調(diào)控及個(gè)體發(fā)育過(guò)程〔11～14〕。在神經(jīng)系統(tǒng)中microRNAs調(diào)節(jié)不同發(fā)育階段及不同部位的病理生理?xiàng)l件下神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化與凋亡，并對(duì)人類(lèi)的認(rèn)知和記憶能力的形成起重要作用〔15，16〕。有些microRNAs以與多聚核糖體結(jié)合的方式存在于神經(jīng)元中〔17，18〕，對(duì)腦的生長(zhǎng)發(fā)育表達(dá)出組織特異性和階段特異性。血清中存在著穩(wěn)定的microRNAs表達(dá)〔19，20〕。本研究旨在分析microRNA-107在A(yíng)D患者血清中表達(dá)。

1 資料和方法

1.1研究對(duì)象 2012年10月至2015年6月連云港市第二人民醫(yī)院住院及門(mén)診就診首次診斷AD的患者，根據(jù)病情程度分為輕度組和中度組各30例；根據(jù)年齡匹配設(shè)正常組30例：為健康體檢者，具有正常功能活動(dòng)能力，無(wú)器質(zhì)性腦病，神經(jīng)系統(tǒng)檢查無(wú)異常，簡(jiǎn)易精神狀態(tài)監(jiān)測(cè)量表(MMSE)評(píng)分在28分以上。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)既往有腦血管疾病者；(2)有顱腦外傷者；(3)有中毒性、代謝性等腦病者；(4)診斷前進(jìn)行藥物治療者；(5)有血液系統(tǒng)疾病者；(6)血管性及其他原因所致癡呆；(7)未知情同意者。記錄所有研究對(duì)象的性別、年齡、既往史(高血壓、糖尿病、冠心病等)、吸煙史、飲酒史及纖維蛋白原(Fg)、高半胱氨酸(HHcy)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、血脂等血液化驗(yàn)指標(biāo)。三組性別、年齡及既往史差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見(jiàn)表1。

1.2AD診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)2011年美國(guó)國(guó)家衰老研究所(NIA)和AD學(xué)會(huì)(AA)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)(NIA-AA診斷標(biāo)準(zhǔn))，AD患者的癡呆分級(jí)根據(jù)MMSE和AD評(píng)定量表認(rèn)知部分(ADAS-cog)量表。根據(jù)MMSE評(píng)分分為：輕度組(15分

1.3樣本采集 輕、中度組治療前采取靜脈血，正常組靜脈血來(lái)自來(lái)體檢中心健康體檢者，所有靜脈血提取血清后放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4總RNA提取 取100～200 μl低溫冷藏的每例血清樣本，置于冰上融化，且充分混勻。加入3倍體積的Trizol LS到樣本中，在震蕩器上充分混勻，室溫放置5～15 min進(jìn)行變性處理。按等體積加入氯仿，振蕩器上充分混勻，室溫放置15 min，在4℃條件下，14 000 r/min離心15 min抽提RNA。

1.5芯片檢測(cè) 抽取每例輕、中度組患者的等量RNA，充分混勻后抽提RNA進(jìn)行microRNA芯片檢測(cè)，并與正常組的microRNA芯片檢測(cè)結(jié)果比較，利用軟件找出差異microRNAs。

1.6逆轉(zhuǎn)錄 用Taqman microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和microRNA特異性莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行microRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，操作按照ABI的流程，進(jìn)行部分調(diào)整，總反應(yīng)體系15 μl。

1.7QT-PCR檢測(cè) 設(shè)計(jì)引物序列，以U6 snRNA 作為內(nèi)參，應(yīng)用QT-PCR把三組microRNA-107進(jìn)行定量分析，然后進(jìn)行相互比較。用2-ΔΔCT計(jì)算microRNA的表達(dá)量,每例樣本重復(fù)檢測(cè)3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)和多因素回歸分析。

表1 3組一般資料對(duì)比(n=30)

1)正常組與輕度組比較；2)正常組與中度組比較；3)輕度組與中度組比較

2 結(jié) 果

2.1基因芯片檢測(cè)結(jié)果 輕度組檢測(cè)出信號(hào)表達(dá)>500的差異microRNAs 35條，其中上調(diào)27條，下調(diào)8條，見(jiàn)圖1；中度組檢測(cè)出信號(hào)表達(dá)>500的差異microRNAs 34條，其中上調(diào)23條，下調(diào)11條，見(jiàn)圖2。輕度組與中度組共同表達(dá)>500的差異microRNAs 26條，其中microRNA-107在列。microRNA-107在輕度組、中度組均顯著下調(diào)microRNA(P<0.01)。

2.2MicroRNA-107 QT-PCR結(jié)果 見(jiàn)表2。輕度組、中度組血清中microRNA-107表達(dá)量較正常組明顯下降(P<0.01),與芯片結(jié)果一致；中度組血清中microRNA-107表達(dá)量較輕度組顯著下降(P<0.01)。

圖1 輕度組與正常組差異microRNAs聚類(lèi)圖

圖2 中度組與正常組差異microRNAs聚類(lèi)圖

表2 3組microRNA-107定量結(jié)果比較

ΔCT.同一個(gè)樣品目標(biāo)基因和內(nèi)參基因平均CT值的差值;ΔΔCT.特定目標(biāo)基因的待檢樣品和校準(zhǔn)樣品ΔCT的差值；與正常組比較：1)P<0.01；與輕度組比較：2)P<0.01

3 討 論

microRNAs與腫瘤〔21，22〕、心血管疾病〔23，24〕、糖尿病〔25〕、神經(jīng)退行性疾病〔26〕的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),與AD的關(guān)系也受到廣泛關(guān)注〔27～29〕。有研究者在A(yíng)D的轉(zhuǎn)基因小鼠模型里檢測(cè)到對(duì)AD有影響的microRNAs〔30，31〕。MicroRNAs在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中能調(diào)節(jié)淀粉樣前體蛋白(APP)的表達(dá)〔32～34〕及影響Aβ沉積〔35〕。Sohonrook 等〔36〕發(fā)現(xiàn)某些microRNAs促進(jìn)了Aβ產(chǎn)生，而Aβ又可改變microRNAs表達(dá)，成為microRNAs網(wǎng)絡(luò)失衡的始發(fā)因子，MicroRNAs與Aβ之間存在一種極其復(fù)雜的聯(lián)系，在體內(nèi)相互促進(jìn)相互影響，從而影響著AD的發(fā)生發(fā)展。MicroRNA-125b被證明可引起tau蛋白高度磷酸化，其機(jī)制在于靶向抑制雙特異性磷酸酶(DUSP)6和蛋白磷酸酶催化亞基α亞型(PPP1CA)而促進(jìn)tau蛋白磷酸化，研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)micro-125b可損害小鼠聯(lián)合型學(xué)習(xí)〔37〕。Lau等〔38〕的研究也證明microRNA-132-3p通過(guò)調(diào)節(jié)tau蛋白的轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)了AD的發(fā)展。可見(jiàn)，MicroRNAs從多種機(jī)制上參與了AD的發(fā)生、發(fā)展。

本研究結(jié)果說(shuō)明microRNA-107下調(diào)可能影響AD的發(fā)生。MicroRNA-107是microRNA-15/107家族成員之一，這個(gè)家族的其他成員還包括microRNA-15,microRNA-16,microRNA-103,microRNA-195,microRNA-424,microRNA-497,microRNA-503,microRNA-646等，這些microRNAs的5′端都有相同的種子序列AGCAGC，正是由于這種5′端序列的同源性促使其在調(diào)控靶mRNA的轉(zhuǎn)錄后降解和翻譯抑制方面有相似的特性〔39〕。目前這個(gè)家族中microRNA-107已證實(shí)與AD的發(fā)生相關(guān)〔40〕，Nelson 等〔41〕發(fā)現(xiàn)AD和輕度認(rèn)知功能障礙(MCI)的患者中microRNA-107表達(dá)水平下降，與本研究結(jié)果一致。Petra等〔42〕研究了血液中12種與AD有關(guān)的microRNAs，其中microRNA-107也表達(dá)下降。MicroRNA-107可能通過(guò)以下相關(guān)機(jī)制影響AD的發(fā)生發(fā)展：(1)Wang等〔43〕對(duì)不同階段AD患者腦組織中的RNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)AD進(jìn)程中microRNA-107的表達(dá)出現(xiàn)不同程度減少，而淀粉蛋白前β位分解酶(BACE)1表達(dá)增加，從而出現(xiàn)相應(yīng)的病理改變，該研究認(rèn)為microRNA-107可通過(guò)與靶基因BACE1的3′端非翻譯區(qū)(UTR)區(qū)結(jié)合調(diào)控BACE1的表達(dá)，繼而增加APP水解后Aβ生成與沉積導(dǎo)致AD的發(fā)生，并可能通過(guò)調(diào)節(jié)BACE1參與加速該病的進(jìn)展；(2)MicroRNA-107也可以誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞周期阻滯〔44〕，并重新進(jìn)入細(xì)胞周期，重新進(jìn)入細(xì)胞周期是AD發(fā)病的早期事件甚至發(fā)生在A(yíng)β和神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)形成之前〔45〕，導(dǎo)致AD的發(fā)生；(3)MicroRNA-107還通過(guò)降低控制APP和淀粉樣斑塊形成解聚素基質(zhì)金屬蛋白酶(ADAM)10的表達(dá)來(lái)影響AD的發(fā)生〔46〕；(4)Peter等〔47〕還證實(shí)AD患者腦組織microRNA-107表達(dá)下降與老年斑及NFTs下降相關(guān)。當(dāng)然，microRNA-107影響AD的機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

綜上，血清中microRNA-107可能間接反映腦組織內(nèi)的microRNA-107表達(dá)變化，但AD患者血清中表達(dá)水平下降的原因和機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。microRNA-107可能會(huì)作為輔助診斷AD的一種潛在的生物標(biāo)志物，為AD提供更全面的早期診斷及判斷預(yù)后指標(biāo)，并且可能成為治療靶點(diǎn)，但microRNA-107表達(dá)水平與AD的診斷是否具有特異性，尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。

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