高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

姚 瑤,霍元鵬,周 偉,葉佳穎,褚夢真,朱森林,蔣紅英

(1.浙江師范大學(xué) 地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004;2.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院,浙江 金華 321007)

β-葡萄糖苷酶可水解結(jié)合在末端的非還原性β-D-葡萄糖苷鍵,同時釋放出葡萄糖體和配基[1],具有良好的增香釀造潛力[2],其在工業(yè)化制備、改善飲品風(fēng)味和酶解工程固化回收處理方面發(fā)揮重要的作用。然而天然酶活性較低往往阻滯了其大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。國內(nèi)外用于研究的β-葡萄糖苷酶主要來源于微生物,這與來源于植物的β-葡萄糖苷酶活性不高、穩(wěn)定性差、產(chǎn)量較低有關(guān)[3-4]。目前對β-葡萄糖苷酶的微生物來源研究較多[5-6],但不同微生物合成β-葡萄糖苷酶的能力有差異[7]；Wilkowska A等[8]也指出β-葡萄糖苷酶的活力普遍很低,產(chǎn)量不高。因此,尋找一種新的高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的真菌是極其必要的。

目前多數(shù)研究的采土樣點較為單一,對同一環(huán)境中不同地理位置的研究不多。本研究使用七葉苷平板法[9]對不同地區(qū)以及不同海拔高度的腐殖質(zhì)土壤中β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌進(jìn)行了篩選,考察了不同生長環(huán)境中菌株產(chǎn)酶能力的差異,得到了β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌,并對其發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到了利于產(chǎn)酶、成本較低、具有較大利用價值的培養(yǎng)基配方,可為β-葡萄糖苷酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌種來源:在金華曹宅山下洪村桔園以及金華北山不同海拔高度處采集長期堆放稻草或覆蓋樹葉的地下5～25 cm土壤,從中分離篩選產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株。初篩培養(yǎng)基為孟加拉紅富集培養(yǎng)基[10];復(fù)篩培養(yǎng)基為剛果紅CMC-Na(羧甲基纖維素鈉)瓊脂培養(yǎng)基[11];發(fā)酵產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組分為麩皮4.0%、(NH4)2SO40.2%、NH4NO30.2%、MgSO4·7H2O 0.05%、KH2PO40.1%，pH自然,于121 ℃滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的篩選

1.2.1.1 土樣的富集、分離及純化 取10 g土樣置于250 mL裝有小玻璃珠的三角瓶中,加入90 mL無菌水,于120 r/min轉(zhuǎn)速下振蕩10 min；在無菌環(huán)境下取0.1 mL的懸液涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基中,觀察微生物的長勢；培養(yǎng)24 h后，從孟加拉紅培養(yǎng)基中挑取長勢較好的菌株,在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基中進(jìn)行多次劃線分離，直至得到幾種不同的純化菌株。

1.2.1.2 目的菌株的初篩與復(fù)篩 將純化的菌株在28 ℃下培養(yǎng)3 d,向每個平板倒入20 mL剛果紅溶液(1 mg/mL),染色30 min后用1 mol/L NaCl溶液進(jìn)行反復(fù)洗滌,測量透明圈和菌落的直徑并計算兩者的比值；選擇兩者比值大的菌落直接進(jìn)行麥麩誘導(dǎo)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩,在28 ℃和轉(zhuǎn)速200 r/min的發(fā)酵條件下培養(yǎng)5 d[12]。

1.2.1.3 粗酶液的制備及酶活力的測定 將目的菌株在28 ℃培養(yǎng)5 d后的發(fā)酵培養(yǎng)液以13000 r/min離心20 min,收集得到的上清液即為粗酶液。取0.5 mL經(jīng)過適當(dāng)倍數(shù)稀釋的酶液,加入1.5 mL CMC-Na溶液，于40 ℃保溫30 min,再加入1.5 mL DNS試劑顯色,沸水浴煮沸5 min,冷卻后稀釋至25 mL,于540 nm處測OD值；以加熱滅活(100 ℃,5 min)的酶液按照同樣方法作空白處理。在上述條件下定義1 mL酶液1 min水解產(chǎn)生1 μmol葡萄糖的酶活力為一個酶活單位(IU/mL)，其計算公式如下:酶活力(IU/mL)=[葡萄糖含量(mg)×稀釋倍數(shù)×5.56]/[反應(yīng)液中酶液加入量(mL)×反應(yīng)時間(min)]。

1.2.2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株液體發(fā)酵條件的優(yōu)化 分別對兩株菌株的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化(表1)。通過3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定菌株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的活力，從而確定菌株產(chǎn)酶的最佳條件。

在培養(yǎng)基優(yōu)化過程中,還需著重考慮培養(yǎng)基所用原材料的來源渠道、價格高低、質(zhì)量穩(wěn)定性等因素,將培養(yǎng)基優(yōu)化至最優(yōu)條件。

表1 菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化時相關(guān)參數(shù)設(shè)置

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的篩選

2.1.1 高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的初篩和復(fù)篩 經(jīng)過初篩和復(fù)篩,有14株菌株在篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生菌落。將這些菌株分別接種于剛果紅培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d,利用剛果紅染色法[13]篩選得到H2的透明圈直徑與菌落直徑比值(HC值)最高,H5次之(表2)。用DNS法測定產(chǎn)酶活力，得知H2和H5的初始酶活力居前2位,分別為0.026和0.023 IU/mL,這兩個菌株都來源于洪村桔園土壤。因此,本實驗選用H2和H5作為進(jìn)一步發(fā)酵培養(yǎng)的研究對象。

2.1.2 目的菌株的鑒定 目的菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng),生長很快,菌落起初為白色,圓形,背面褐色,培養(yǎng)5～7 d后直徑可達(dá)2.5～2.8 cm。菌株在分離純化培養(yǎng)皿上菌絲體產(chǎn)生大量長短不一的分生孢子梗,分生孢子梗頂端膨大，形成近球型頂囊,分生孢子頭黑色、球形,有多分支的有隔菌絲。分生孢子壁光滑,菌絲體透明(圖1～圖2)。根據(jù)菌落形態(tài)和菌絲觀察,菌株H2和H5與標(biāo)準(zhǔn)黑曲霉菌株極為相似,可將這2個菌株初步鑒定為曲霉菌屬黑曲霉(Aspergillusniger)。

2.2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株液體發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果及分析

2.2.1 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

2.2.1.1 碳源對產(chǎn)酶活力的影響 H2和H5經(jīng)培養(yǎng)5 d后，酶活力分別達(dá)到2.65和2.26 IU/mL,較初始酶活力分別提高了100.9%和97.3%。對于H2菌株，碳源為蔗糖時酶活力最高,其次則是紅糖(圖3)，這可能與碳源中可生成還原糖的物質(zhì)總量有關(guān),因為紅糖中還原糖含量略少于蔗糖。對于H5菌株,紅糖和蔗糖作碳源效果都比較好,紅糖作為碳源時酶活力更高。因此,H2以蔗糖作為產(chǎn)酶時最佳碳源,H5則用紅糖作為最佳碳源。

圖1 菌株H2的菌落形態(tài)及在顯微鏡下的形態(tài)

圖2 菌株H5的菌落形態(tài)及在顯微鏡下的形態(tài)

表2 目的菌株的菌落直徑、透明圈直徑及其比值和酶活力

2.2.1.2 氮源對產(chǎn)酶活力的影響 從圖4可以看出：當(dāng)?shù)礊榱蛩徜@+尿素(1∶1)時,H2菌株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的活力最大,為6.36 IU/mL,酶活力在最佳碳源的基礎(chǔ)上又提高了140%；H5的最佳氮源為硫酸銨+硝酸銨(1∶1),其酶活力又提高了196%。在所有供試氮源的條件下,H2的產(chǎn)酶活力均在3.50 IU/mL至4.66 IU/mL之間；除以硫酸銨+尿素(1∶1)、硫酸銨為氮源時H5的產(chǎn)酶活力在2 IU/mL以下外,其余也都達(dá)到3.5 IU/mL以上,優(yōu)化效果較為明顯。因此氮源種類對于菌株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力的影響十分明顯,H2的最佳氮源為硫酸銨+尿素(1∶1),H5的最佳氮源為硫酸銨+硝酸銨(1∶1)。

圖3 碳源對H2和H5菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力的影響

2.2.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.2.1 培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶活力的影響 H2和H5所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的活力隨著培養(yǎng)時間的增加而增加,在培養(yǎng)5 d時酶活力均達(dá)到最大，分別達(dá)到0.85和0.82 IU/mL,分別比初始酶活力增加了192%和113%；在培養(yǎng)5 d之后酶活力逐漸下降(圖5)。因此,本實驗以5 d為培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

圖4 氮源對H2和H5菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力的影響

圖5 培養(yǎng)時間對H2和H5菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力的影響

2.2.2.2 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶活力的影響 培養(yǎng)溫度對H2和H5產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力的影響趨勢幾乎相同,在28 ℃下所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的活力均最高(圖6)。

2.2.2.3 pH值對產(chǎn)酶活力的影響 當(dāng)pH值為4.0和4.5時,H2和H5分別顯示最高酶活力1.10和0.82 IU/mL(圖7)。該結(jié)果與Ruchi[3]和Paula等[5]的研究結(jié)果“產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株培養(yǎng)基的最適起始pH值介于4.0～5.0”一致。液體發(fā)酵培養(yǎng)基呈酸性,菌株從該培養(yǎng)基中復(fù)篩得到,因而也適應(yīng)酸性環(huán)境。

3 討論

本次實驗發(fā)現(xiàn)：在北山采集的腐殖質(zhì)土壤中大量存在產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株,并且只要采用適當(dāng)?shù)募兓昂Y選方法即可得到產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株；而桔園土壤由于受到人工施肥等因素的影響，從中篩選得到的產(chǎn)酶菌株種類少,這也說明β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌的研究充滿很多可能性。從腐殖質(zhì)土壤中篩選出來的菌株初始所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的活力比較低,一般都需要經(jīng)過發(fā)酵條件的優(yōu)化來初步提高其產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的活力。

圖7 pH值對H2和H5菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力的影響

本實驗結(jié)果顯示，對于篩選出的兩株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株H2和H5,當(dāng)碳源為蔗糖,氮源為硫酸銨+尿素(1∶1),培養(yǎng)時間為5 d，培養(yǎng)溫度為28 ℃,pH值為4.0或4.5時,其所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的活力最大。當(dāng)然不同因素對菌株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力的影響程度不盡相同,例如在本次實驗中,培養(yǎng)溫度對酶活力的影響最大，碳源種類、氮源種類、培養(yǎng)時間次之，這與劉小杰等的優(yōu)化分析結(jié)果[14]一致。而由于大多數(shù)酶在酸性范圍內(nèi)都具有較好的穩(wěn)定性,煙曲霉的相對活性在pH 3.0～6.0內(nèi)都很穩(wěn)定[16]，故本實驗對pH值的優(yōu)化效果不太明顯。因此,在實際應(yīng)用中,應(yīng)選擇最適的培養(yǎng)溫度為主要優(yōu)化手段,這樣可以最大程度地提高β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)量。當(dāng)然,其他發(fā)酵條件的優(yōu)化也較重要。若能將發(fā)酵工藝條件進(jìn)一步優(yōu)化,則有望實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

4 結(jié)論

利用羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基,采用剛果紅染色法,并進(jìn)一步利用液體發(fā)酵培養(yǎng)基篩選得到黑曲霉2株。

H2菌株的最適產(chǎn)酶條件:液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為4 g/L蔗糖、0.4 g/L 1∶1混合的硫酸銨與尿素、0.3 g/L MgSO4、0.3 g/L CaCl2、4 g/L KH2PO4,初始pH 4.0。H5發(fā)酵培養(yǎng)基則以紅糖為最佳碳源，以硫酸銨+硝酸銨(1∶1)為最佳氮源,最佳初始pH值為4.5。在28 ℃下，發(fā)酵培養(yǎng)到第5天時, H2和H5菌株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的活力均最大，分別達(dá)到6.36和6.70 IU/mL。

[1] 侯曉瑞,王婧,楊學(xué)山,等.甘肅河西走廊葡萄酒產(chǎn)區(qū)高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株篩選[J].食品科學(xué),2014,35(23):139-143.

[2] 陶永勝,朱曉琳,馬得草,等.葡萄汁有孢漢遜酵母糖苷酶增香釀造葡萄酒的潛力分析[J].農(nóng)業(yè)機械學(xué)報,2016,47(10):280-286.

[3] Ruchi A, Verma A K, Satlewal A. Application of nanoparticle-immobilized thermostable β-glucosidase for improving the sugarcane juice properties [J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2016, 33: 472-482.

[5] González-Pombo P, Faria L, Carrau F, et al. Aroma enhancement in wines using co-immobilizedAspergillusnigerglycosidases [J]. Food Chemistry, 2014, 143: 185-191.

[6] 王英,周劍忠,胡彥新,等.低活性β-葡萄糖苷酶酵母菌株的篩選及其在黑莓果酒發(fā)酵中的應(yīng)用[J].中國釀造,2016,35(7):102-107.

[7] ?elik A, Din?er A, Aydemir T. Characterization of β-glucosidase immobilized on chitosan-multiwalled carbon nanotubes (MWCNTS) and their application on tea extracts for aroma enhancement [J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2016, 89: 406-414.

[8] Wilkowska A, Pogorzelski E. Aroma enhancement of cherry juice and wine using exogenous glycosidases from mould, yeast and lacticacid bacteria [J]. Food Chemistry, 2017, 237: 282-289.

[9] 李松,楊倩,范李龍,等.堿性β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌株的篩選、鑒定及部分酶學(xué)性質(zhì)研究[J].食品工業(yè)科技,2016,37(2):180-184,188.

[10] 林華清,曾令杰,王嘉樂,等.煙草及煙草制品中霉菌數(shù)量檢驗用培養(yǎng)基的開發(fā)與應(yīng)用[J].煙草科技,2014(11):29-32.

[11] 余麗,晏愛芬.高黎貢山土壤中纖維素分解菌的篩選[J].生物學(xué)雜志,2012,29(2):34-36,76.

[12] 崔麗虹,李積華,吳浩.篩選產(chǎn)纖維素酶絲狀真菌的剛果紅法之比較[J].廣東化工,2015,42(1):30-31,36.

[13] 劉瑞艷,侯運華,王逸凡,等.里氏木霉VPS13基因缺失對菌絲分支、生孢和纖維素酶產(chǎn)量的影響[J].微生物學(xué)報,2017,57(10):1555-1566.

[14] 劉小杰,何國慶,陳啟和,等.黑曲霉β-葡萄糖苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].中國食品學(xué)報,2006(6):6-10.

[15] 錢超,楊文丹,張賓樂,等.高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌在葡萄汁酸面團(tuán)面包中的應(yīng)用[J].食品與機械,2017,33(5):14-20.

[16] 羅軍俠,李江華,陸健,等.耐酸性淀粉糖化酶的菌種篩選、酶的性質(zhì)及發(fā)酵條件[J].食品工業(yè)科技,2008(5):151-154.