麻醉對大鼠海水浸泡體溫過低癥模型的影響

奐劍波，陳麗娜，史成和，代 維，袁丹鳳，周繼紅，韓志海

體溫過低癥是指機(jī)體核心溫度低于35 ℃的狀態(tài)，嚴(yán)重者可導(dǎo)致多器官功能障礙綜合癥，救治極為困難[1]。海水浸泡是導(dǎo)致體溫過低癥的重要原因，海水落水獲救低溫傷員與其他原因(如雪崩掩埋)導(dǎo)致的體溫過低癥相比，通常并未完全昏迷，無明顯呼吸道阻塞現(xiàn)象等，其預(yù)后有所不同[2]。對于海水浸泡型體溫過低癥的研究需要建立相應(yīng)的大鼠模型，現(xiàn)有模型多數(shù)在麻醉?xiàng)l件下完成，然而麻醉對于呼吸、心血管活動(dòng)的抑制與低溫可能有協(xié)同作用，由此帶來的病理生理改變不盡相同，麻醉對建立重度體溫過低癥大鼠模型的影響亟待明確。本研究通過實(shí)驗(yàn)對比麻醉與不麻醉大鼠海水浸泡性體溫過低癥模型建立時(shí)的腹腔溫度、活動(dòng)-意識狀況、呼吸、心率、肌顫、死亡率等差異，探討麻醉對于大鼠體溫過低癥模型建立的作用與影響，并討論不麻醉大鼠模型建立的可行性及適用范圍。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與特殊儀器材料 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠由第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[SCXK(渝)2012-0005] ；實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)海軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)；冷熱恒溫水槽(型號TC-LR650，上海雙舜實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)；溫度記錄器(iButton,型號DS1922L，Maxim/Dallas公司生產(chǎn)；設(shè)置溫度記錄啟動(dòng)時(shí)間為預(yù)期低溫浸泡實(shí)驗(yàn)前8 h，溫度記錄頻次1/min，放入90℃融化石蠟中浸泡3 s，取出冷卻，75%乙醇中浸泡消毒30 min備用)；自制大鼠水浴固定器；海鹽(廣州益爾生物工程有限公司，按比例配制鹽度3%海水浸泡用)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法與觀察指標(biāo)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)前處理與分組 大鼠實(shí)驗(yàn)前10 d麻醉，備皮，消毒，右上腹開2 cm切口，將預(yù)處理后的溫度記錄器置入腹腔，縫合切口并涂抹紅霉素軟膏，大鼠蘇醒后常規(guī)單籠飼養(yǎng)，每天給予青霉素鈉20萬U腹腔注射,連續(xù)3 d，術(shù)后連續(xù)觀察10 d，選取大鼠手術(shù)切口愈合良好無感染，體重穩(wěn)定增長，活動(dòng)自如，飲食排便良好的40只大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，體重(286.5±10.7)g，按隨機(jī)數(shù)法隨機(jī)分為生理鹽水腹腔注射組(對照組)和1.5%戊巴比妥鈉腹腔注射組(麻醉組)，每組20只。

1.2.2 低溫海水浸泡實(shí)驗(yàn) 大鼠稱重后，麻醉組按體重30 mg/kg給予1.5%戊巴比妥鈉腹腔注射，對照組按體重相應(yīng)給予麻醉藥相同體積生理鹽水腹腔注射，10 min待麻醉組完全麻醉后將2組大鼠同時(shí)放入自制大鼠水浴固定器內(nèi)，然后置入(15±0.2)℃鹽度3%海水中浸泡，浸泡深度為鎖骨水平，每10 min觀測并記錄1次大鼠活動(dòng)意識狀況(分級標(biāo)準(zhǔn)見后)、呼吸頻率、心率、肌顫頻率等，浸泡2 h后，每30 min觀測上述數(shù)據(jù)，如死亡記錄死亡時(shí)間；浸泡實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死大鼠，取出溫度記錄器，用專用儀器和軟件讀取腹腔溫度數(shù)據(jù)。

1.2.3 SD大鼠活動(dòng)意識簡易分級標(biāo)準(zhǔn) 分為7級：應(yīng)激反應(yīng)激烈，活動(dòng)顯著增強(qiáng)；6級：較平靜狀態(tài)，活動(dòng)稍加強(qiáng)；5級：平靜穩(wěn)定，活動(dòng)自如；4級：意識稍微抑制，活動(dòng)度減低；3級：無明顯活動(dòng)，對輕刺激有反應(yīng)；2級：無活動(dòng)，對強(qiáng)刺激有反應(yīng)；1級：深度昏迷，對強(qiáng)刺激無任何反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 腹腔溫度 實(shí)驗(yàn)前對照組與麻醉組腹腔溫度均正常，分別為(37.8±0.5)℃和(38.2±0.1)℃，在腹腔注射10 min后2組腹腔溫度均略有下降，對照組降幅(0.7±0.5)℃明顯小于麻醉組(1.8±0.5)℃(t=7.19，P<0.05)；海水浸泡后均快速下降，浸泡120 min左右逐漸接近水溫，然后維持相對穩(wěn)定的低溫狀態(tài)(將浸泡120 min前后分為體溫下降期和低溫維持期)。體溫下降期內(nèi)，2組均在10 min左右下降速度最快，且該時(shí)間點(diǎn)麻醉組腹腔溫度小于對照組[差值為(0.9±0.3)℃，t=3.01，P<0.05] ，30 min后下降速度趨緩，2組間差值逐漸減??；維持期對照組腹腔溫度(15.7±0.2)℃高于麻醉組(15.6±0.2)℃(t=3.72，P<0.05)，見圖1A。典型單個(gè)大鼠腹腔溫度連續(xù)變化曲線見圖3。

2.2 活動(dòng)意識等級 實(shí)驗(yàn)前對照組與麻醉組中位活動(dòng)意識等級均為5級，腹腔注射后對照組升至6級，而麻醉組降至3級；海水浸泡后對照組先迅速上升至7級，維持20 min左右，后快速下降并于60 min時(shí)降至3級，繼而階梯式緩慢下降，于300 min時(shí)降至1級，而麻醉組中位活動(dòng)意識等級則持續(xù)階梯式下降，于40 min左右降至2級，80 min左右降至1級。體溫下降期對照組中位活動(dòng)意識等級均大于麻醉組，差異先增大后減小，10 min時(shí)2組差異最大(分別為7級和3級，Z=5.94，P<0.05)；維持期2組中位活動(dòng)意識等級差異明顯(分別為2級和1級，Z=9.11，P<0.05)，見圖1B。

2.3 心率 實(shí)驗(yàn)前對照組與麻醉組心率均正常，分別為(366.0±26.4)/min和(397.8±16.6)/min，腹腔注射10 min后對照組升高了(32.5±23.2)/min，而麻醉組降低了(49.8±7.7)/min(變化幅度對比，t=15.08，P<0.05)；海水浸泡后對照組繼續(xù)升高，于10 min左右達(dá)到峰值，然后先快速下降后緩慢下降，至浸泡120 min時(shí)在較低水平維持相對穩(wěn)定，而麻醉組心率在浸泡過程中持續(xù)下降，下降速度先快后慢，至浸泡120 min左右低水平維持相對穩(wěn)定。整個(gè)浸泡過程中各時(shí)間點(diǎn)對照組心率均大于麻醉組，差值先增大后變小，10 mim時(shí)2組差值最大(156.0±8.7)/min(t=17.83，P<0.05)；維持期對照組心率(81.0±10.4)/min仍高于麻醉組(55.9±6.7)/min(t=15.49，P<0.05)，見圖1C。

2.4 呼吸頻率 實(shí)驗(yàn)前對照組與麻醉組呼吸頻率均正常，分別為(85.4±11.0)/min和(90.9±3.4)/min，腹腔注射10 min后對照組升高了(5.9±5.4)/min，而麻醉組降低了(9.4±2.5)/min(變化幅度對比，t=11.5，P<0.05)；海水浸泡后對照組升高，于10 min左右達(dá)到峰值，然后先快速下降后緩慢下降，至浸泡120 min時(shí)在較低水平維持相對穩(wěn)定，而麻醉組在浸泡過程中持續(xù)降低，速度先快后慢，至浸泡120 min左右低水平維持相對穩(wěn)定。整個(gè)浸泡過程中各時(shí)間點(diǎn)對照組呼吸頻率均大于麻醉組，差值先增大后變小，10 min時(shí)2組差值最大為(44.1±3.7)/min(t=12.05，P<0.05)；維持期對照組呼吸頻率(18.5±2.4)/min仍高于麻醉組(13.9±1.4)/min(t=13.7，P<0.05)，見圖1D。

2.5 肌顫頻率 實(shí)驗(yàn)前對照組與麻醉組均無肌顫產(chǎn)生，腹腔注射后2組仍無肌顫。海水浸泡后，對照組全部、麻醉組大部分(85%)大鼠出現(xiàn)肌顫，頻率均逐漸升高，對照組升高速度較麻醉組快，2組峰值均在浸泡20 min左右出現(xiàn)，對照組(46.5±11.8)/min明顯高于麻醉組(2.8±3.2)/min(t=15.99，P<0.05)，后2組肌顫均逐漸下降，對照組于110 min肌顫完全消失，晚于麻醉組(80 min)，見圖1E。

2.6 死亡率 實(shí)驗(yàn)過程中對照組首只大鼠死亡時(shí)間(80 min)晚于麻醉組(60 min)；對照組死亡率(35%)明顯低于麻醉組(75%)(χ2=6.47，P<0.05)；對照組中位死亡時(shí)間(165 min)晚于麻醉組(115 min)(圖2)。

圖1 SD大鼠低溫海水浸泡生命體征觀察注：圖中時(shí)間點(diǎn)“-10 min”為腹腔注射生理鹽水或者1.5%戊巴比妥鈉前，“0 min”為入水浸泡前，其余為浸泡后時(shí)間點(diǎn)

圖2 SD大鼠低溫海水浸泡生存曲線

圖3 典型腹腔溫度連續(xù)變化曲線

3 討論

海水浸泡性體溫過低癥在現(xiàn)代海戰(zhàn)中發(fā)生率較高，傷情較重，是海戰(zhàn)傷救治研究的重要內(nèi)容[3]。麻醉與否是區(qū)別意外性體溫過低癥和治療性低溫的一個(gè)重要特征，通常麻醉狀態(tài)下程序化的低溫處理對于人體的損傷明顯小于野外環(huán)境中低溫對人的直接損傷，故在建立大鼠模型研究海水浸泡性體溫過低癥時(shí)需要對是否麻醉進(jìn)行謹(jǐn)慎的思考[4]。采用不麻醉大鼠進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)涉及動(dòng)物倫理，本研究中我們將不麻醉大鼠采用自制水浴固定器固定，盡可能減少了其對于低溫海水環(huán)境應(yīng)激，同時(shí)由于低溫本身的“麻醉”效應(yīng)，意識逐漸散失，其在死亡前很長時(shí)間內(nèi)感受的傷害痛苦值可認(rèn)為較輕，符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求；另外，該固定器還有效防止大鼠海水浸泡時(shí)的淹溺。建立不麻醉大鼠體溫過低癥模型，核心溫度的監(jiān)測采用傳統(tǒng)的麻醉時(shí)測溫方式顯然是不合適的，本團(tuán)隊(duì)預(yù)實(shí)驗(yàn)中利用電子溫度探針同時(shí)檢測低溫海水浸泡大鼠肛門、腹腔、胸腔溫度，發(fā)現(xiàn)腹腔溫度較肛門溫度更接近胸腔溫度，更能反映機(jī)體核心體溫。楊明等[5]利用連續(xù)溫度記錄系統(tǒng)回顧性描繪了不麻醉達(dá)烏爾黃鼠冬眠期間腹腔溫度變化曲線，本研究將該方法成功運(yùn)用到不麻醉大鼠低溫海水浸泡實(shí)驗(yàn)中，獲取了不麻醉大鼠的連續(xù)腹腔溫度變化曲線，避免了頻繁測溫對于不麻醉大鼠低溫浸泡實(shí)驗(yàn)的影響。大鼠比人更能耐受低溫，人核心體溫(通常指肛溫)達(dá)到28 ℃以下時(shí)即為重度體溫過低癥[1]，而在此核心溫度下大鼠的生存幾乎不受影響；科學(xué)家們習(xí)慣將大鼠的肛溫下降至15 ℃左右作為重度體溫過低癥的標(biāo)準(zhǔn)，低溫維持時(shí)間0.5～10 h不等[6-8]。本研究中麻醉與不麻醉大鼠模型腹腔溫度最終均穩(wěn)定在15～16 ℃，屬于重度海水浸泡性體溫過低癥模型。

研究發(fā)現(xiàn)建立海水浸泡體溫過低癥過程中麻醉不僅對意識產(chǎn)生了直接的抑制作用，同時(shí)也使大鼠腹腔溫度曲線發(fā)生了細(xì)微的變化，不僅使主動(dòng)活動(dòng)消失，同時(shí)也使被動(dòng)肌肉收縮發(fā)生困難，另外對于呼吸和心血管系統(tǒng)的影響無論在體溫下降期還是低溫維持期都是明顯而且巨大的，最終大大提高了海水浸泡體溫過低癥大鼠的死亡率，并使中位死亡時(shí)間提前。主要原因?yàn)?，戊巴比妥鈉作為常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉用藥，具有擬γ-氨基丁酸的作用，能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸后膜γ-氨基丁酸受體結(jié)合，在沒有γ-氨基丁酸時(shí)大劑量戊巴比妥鈉能直接活化Cl-通道，Cl-的大量內(nèi)流使突觸后膜發(fā)生超級化，進(jìn)而降低突觸后神經(jīng)元的興奮性，并主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上行激活系統(tǒng)，達(dá)到催眠、鎮(zhèn)靜效果，同時(shí)對呼吸和循環(huán)也有顯著的抑制作用[9]。有趣的是，與不麻醉相比，雖然麻醉大鼠主動(dòng)、被動(dòng)活動(dòng)(肌顫)被抑制，呼吸、心血管功能減弱，理論上麻醉大鼠的體溫下降比不麻醉大鼠更快，然而本研究中體溫下降過程中麻醉組較對照組腹腔溫最大差異僅約0.9 ℃，麻醉對于SD大鼠海水浸泡時(shí)腹腔溫變化差異并無想象中明顯，且低溫海水浸泡初始階段腹腔溫均呈現(xiàn)斷崖式下降，未出現(xiàn)顯著的體溫代償效應(yīng)。原因可能為，SD大鼠相對于大動(dòng)物或者人體重輕、體壁薄，機(jī)體與外界熱量交換缺乏縱深，難以代償?shù)蜏睾Ｋ畬τ跓崃康募橙?，由于海水良好的?dǎo)熱性能，浸泡海水溫度與體壁厚度成為了核心溫度下降速度的決定因素，其主動(dòng)或者被動(dòng)的生理產(chǎn)熱對溫度曲線變化的影響相對降低，在大動(dòng)物或者人類，由于體壁厚、主動(dòng)活動(dòng)代償?shù)?，體溫下降曲線可能呈反S下降的過程，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。鑒于麻醉對建立重度海水浸泡體溫過低癥大鼠模型的巨大影響，我們在進(jìn)行相關(guān)研究時(shí)需要根據(jù)研究目的對2種大鼠模型進(jìn)行對比選擇。

目前常用麻醉大鼠建模[7, 10]，麻醉大鼠具有操作便利、測溫方式選擇多樣、檢測指標(biāo)容易等優(yōu)點(diǎn)，然而不麻醉大鼠在反映真實(shí)海水浸泡低溫?fù)p傷時(shí)具有優(yōu)勢，且在某些研究方向難以被麻醉大鼠替代。首先，意識狀況是體溫過低癥分級的重要參考依據(jù)，重度體溫過低癥傷員意識均模糊或者消失，細(xì)化海水浸泡體溫過低癥分級標(biāo)準(zhǔn)時(shí)需要在實(shí)驗(yàn)中保持大鼠處于清醒狀態(tài)，同時(shí)重度體溫過低癥傷員救治成功后神經(jīng)系統(tǒng)的改變也是研究熱點(diǎn)之一[11]，不麻醉大鼠模型在研究低溫與神經(jīng)意識相互關(guān)系時(shí)具有優(yōu)勢。其次，應(yīng)激反應(yīng)在低溫海水浸泡損傷中扮演重要角色，人體落水時(shí)促腎上腺皮質(zhì)素、糖皮質(zhì)激素、甲狀腺素、胰高血糖素等均分泌增高[12]，機(jī)體由此發(fā)生一系列相應(yīng)變化，然而隨著低溫維持時(shí)間延長其變化趨勢不甚明了，其對體溫過低癥的救治影響較大，均需要以不麻醉大鼠來進(jìn)行研究。另外，麻醉雖然對于海水浸泡大鼠體溫下降及低溫維持階段的溫度變化曲線影響不大，但是由于其對能量代謝的影響固定存在的，這種影響反而更易在脫離低溫海水浸泡環(huán)境中表現(xiàn)出來，很可能對于大鼠體溫恢復(fù)能力的產(chǎn)生影響，加之麻醉與否還與自身活動(dòng)導(dǎo)致能量物質(zhì)貯備的消耗有關(guān)，不麻醉大鼠更能模擬體溫過低癥復(fù)溫過程中能量代謝變化趨勢，對于海水浸泡體溫過低癥的救治更加具有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

綜上所述，麻醉對建立重度海水浸泡性體溫過低癥大鼠模型影響較大，麻醉與不麻醉大鼠模型在研究海水浸泡體溫過低癥時(shí)各有優(yōu)缺點(diǎn)，不麻醉大鼠模型在低溫與神經(jīng)系統(tǒng)相互關(guān)系、低溫與應(yīng)激反應(yīng)、復(fù)溫時(shí)能量代謝等方面的研究更具優(yōu)勢。

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