疳積合劑等制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高的研究

鄔杏龍 趙學(xué)龍 李晴 李文

摘要：目的通過薄層色譜鑒別（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）的實(shí)驗(yàn)方法，為醫(yī)院中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高奠定基礎(chǔ)。方法對本院制劑-疳積合劑中威靈仙、使君子，補(bǔ)血復(fù)明合劑中何首烏進(jìn)行薄層鑒別，并通過高效液相色譜法對多動安口服液有效成分芍藥苷進(jìn)行含量測定。結(jié)果疳積合劑中威靈仙和補(bǔ)血復(fù)明合劑中何首烏在薄層色譜上具有鑒別特征，斑點(diǎn)清晰無干擾，而使君子在薄層色譜中無清晰斑點(diǎn)，還有待研究;初步摸索出HPLC測定多動安口服液中芍藥苷的含量方法。結(jié)論薄層色譜鑒別方法可用于疳積合劑中威靈仙和補(bǔ)血復(fù)明合劑中何首烏的質(zhì)量控制;高效液相色譜法簡便、準(zhǔn)確，能精確反映有效成分的含量。

關(guān)鍵詞：薄層色譜鑒別法;威靈仙;高效液相色譜法;芍藥苷

中圖分類號：R285? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? 文章編號：1007-2349（2018）05-0073-04

Study on Improvement of Quality Standards for Anti-malnutrition Compounds

WU Xing-long，ZHAO Xue-long，LI Qing，LI Wen

（Traditional Chinese Hospital of Nanjing City，Nanjing 210001，China）

【Abstract】Objective：To establish the basis for improving the quality standards of traditional Chinese medicine compounds in our hospital by TLC and HPLC Methods：The contents of Radix clematidis and Quisqualis indica in anti-malnutrition compounds in our hospital and Polygonum multiflorum in blood-supply and eyesight-improvement compounds were identified by TLC Additionally，HPLC was applied to measure the contents of paeoniflorin in anti-hyperactivity oral agent Results：The contents of Radix clematidis in anti-malnutrition compounds and Polygonum multiflorum in blood-supply and eyesight-improvement compounds were identifiable with clear spots and free of disturbance by TLC，however，Quisqualis indica was not detectable due to obscure spots in TLC We had preliminarily explored the method for determining paeoniflorin content in anti-hyperactivity oral agent Conclusion：TLC can be used to control the quality of Radix clematidis in anti-malnutrition compounds and Polygonum multiflorum in blood-supply and eyesight-improvement compounds HPLC is simple，accurate and can precisely reflect the contents of active ingredients

【Key words】TLC，radix clematidis，HPLC，paeoniflorin

疳積合劑由使君子、威靈仙等7味中藥飲片的水煎液提純加工制備而成，其功效是消積治疳，適用于小兒疳積，腹部膨脹，消化不良等癥狀。本次實(shí)驗(yàn)對疳積合劑中威靈仙、使君子兩味中藥進(jìn)行薄層鑒別研究。補(bǔ)血復(fù)明合劑由何首烏、白芍、黨參等19味中藥材的水煎液提純加工制備而成，補(bǔ)血復(fù)明合劑滋補(bǔ)肝腎，健脾益氣，養(yǎng)血明目，用于防治近視及各種視力下降，衰老久病之內(nèi)障眼病[1]。何首烏為主藥，對本品中何首烏進(jìn)行定性鑒別，具有重要意義。

多動安口服液具有滋腎平肝、養(yǎng)心益智、寧神定志的功效，主要由白芍、當(dāng)歸、鉤藤等藥物組成。根據(jù)文獻(xiàn)了解白芍主要含有芍藥苷等成分[2]，且芍藥苷具有多種藥理活性[3-4]。因此，實(shí)驗(yàn)選用芍藥苷作為指標(biāo)，對多動安口服液中白芍進(jìn)行含量測定，摸索其高效液相色譜條件，建立含量測定方法，從而增加量化指標(biāo)，提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1.儀器Agilent 1290 Infinity超高壓液相色譜儀、VWD紫外檢測器（均為安捷倫科技有限公司生產(chǎn)）、色譜柱Diamonsil C18（2），5 um，250×46 mm（濟(jì)南賽暢科學(xué)儀器有限公司）、KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、DH-9241A電熱恒溫干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、OK-526電熱恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械產(chǎn)）、AL104分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）、研缽、分液漏斗、燒杯、蒸發(fā)皿、錐形瓶、移液管、容量瓶（10 mL，25 mL，50 mL）等。

1.2.試藥甲醇（分析純）、甲醇（色譜純）、無水乙醇、石油醚（60℃～90℃）、石油醚（30℃～60℃）、甲苯、乙酸乙酯、甲酸、硫酸、濃鹽酸、氨水等試劑，以上藥品均來自南京化學(xué)試劑有限公司;10%硫酸乙醇溶液、10%三氯化鐵乙醇溶液顯色劑（理化實(shí)驗(yàn)室配制）;大孔吸附樹脂（上海勁凱樹脂有限公司）。實(shí)驗(yàn)制劑為疳積合劑（南京市中醫(yī)院 批號：170229）、補(bǔ)血復(fù)明合劑（南京市中醫(yī)院 批號：170710）、多動安口服液（南京市中醫(yī)院 批號：170231）、石燕（煅）、谷精草、石決明（煅）、威靈仙、使君子、雞內(nèi)金（砂燙）、茯苓、何首烏等中藥飲片均由安徽滬春堂中藥飲片廠提供，芍藥苷對照品（批號：110736-201640）購自于中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1.疳積合劑中威靈仙的薄層鑒別

211供試品溶液的制備取疳積合劑55 mL，濃縮至40 mL，加濃鹽酸6 mL，水浴加熱回流1 h，加水20 mL，放冷，加石油醚（60 ℃～90 ℃）50 mL振搖，萃取，石油醚蒸干，殘留物用無水乙醇1 mL溶解，作為供試品溶液[5]。

2.1.2.對照藥材溶液的制備稱威靈仙藥材10 g，置于研缽中，研細(xì)，加水100 mL浸泡30 min，煎煮1 h，濾過，濾渣加水80 mL，煎煮1 h，濾過，合并濾液，濃縮至40 mL。同“111供試品溶液的制備”項(xiàng)下同法制成1 mL對照品溶液。

2.1.3.對照品溶液的制備取齊墩果酸對照品，加無水乙醇制成每lm l含045 mg的溶液，作為對照品溶液[13]。

2.1.4.陰性對照溶液的制備按處方比例，取除去威靈仙以外的其余藥材，同供試品溶液制備方法制成缺威靈仙陰性對照品溶液。

2.1.5.薄層層析照薄層色譜法[6]試驗(yàn)，分別吸取上述四種溶液50 uL，50 uL，30 uL，10 uL點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20：3：02）為展開劑，預(yù)飽和20 min，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)清晰，在自然光下檢視。結(jié)果：供試品色譜在與對照藥材、對照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的紫紅色斑點(diǎn)，陰性對照品在相應(yīng)位置無紫紅色斑點(diǎn)。見圖1。

2.2.補(bǔ)血復(fù)明合劑中何首烏的薄層鑒別

2.2.1.供試品溶液的制備取補(bǔ)血復(fù)明合劑20 mL，濃縮至5 mL，加至已處理好的大孔吸附樹脂柱（DA-201，15*15-20 cm），使藥汁緩慢通過樹脂柱（1 mK/min），待藥汁吸盡后，繼以純化水200 mL沖洗（5 mL/min），棄去水洗液，再以80%乙醇80 mL沖洗樹脂柱（2 mL/min），收集洗脫液，水浴蒸干，殘留物以甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。

2.2.2.對照藥材溶液的制備取制何首烏對照藥材1 g，加水200 mL浸泡30 min，煎煮30 min，過濾，濾液濃縮至5 mL。同“供試品溶液的制備”項(xiàng)下同法制成1 mL對照品溶液。

2.2.3.薄層層析照薄層色譜法（中國藥典2015年版一部附錄VI B）試驗(yàn)，分別吸取供試品液與對照藥材液各10 uL，點(diǎn)于同一塊硅膠G板，并使成約1 cm長的橫條狀，以甲苯-無水乙醇（2：1）為展開劑，展開3～4 cm，取出，晾干，繼以甲苯—無水乙醇（4：1）為展開劑，展開約7～10 cm，取出，晾干，置濃氨水缸中熏2～3 min，于日光下檢視。結(jié)果：供視品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的色斑。見圖2。

2.3.含量測定研究[7-8]

2.3.1.色譜條件色譜柱為Diamonsil C18（2），5 um，250×46 mm，以甲醇-水（25∶75）為流動相，柱溫室溫，流速為1 mLmin-1，檢測波長為230 nm。在此條件下，樣品中芍藥苷與相鄰成分達(dá)到基線分離，見圖3～4。

2.3.2.供試品溶液的制備取多動安口服液2 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用02 um的微孔濾膜濾過，即得。

2.3.3.對照品溶液的制備精密稱取芍藥苷對照品1020 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得04080 mg/mL的儲備液。

2.3.4.線性關(guān)系試驗(yàn)精密量取上述儲備液，用甲醇稀釋，配制6種不同濃度對照品溶液，其濃度分別為00408、00510、00816、01020、02040、04080 mg/mL，分別精密吸取10 uL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以對照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，根據(jù)結(jié)果精確繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=14955X-29194，r=09999（n=6）。結(jié)果表明芍藥苷濃度在408～408 ug范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見圖5。

2.3.5.精密度試驗(yàn)精密吸取芍藥苷對照品溶液2040 ug/mL，在上述色譜條件下，進(jìn)樣10 uL，重復(fù)進(jìn)樣6，測定峰面積，計(jì)算，結(jié)果對照品的RSD為022%，結(jié)果見表1

2.3.6.重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品6份，按供試品溶液制備方法制備，在上述色譜條件下，進(jìn)樣10 uL，測定峰面積，計(jì)算含量，芍藥苷平均含量為01410 mg/mL，RSD為186%，結(jié)果見表2。

2.3.7.穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取供試品溶液10 uL，在上述色譜條件下，分別于0、2、4、6、12 h進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算，RSD為098%，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定，結(jié)果見表3。

2.3.8.加樣回收率試驗(yàn)精密量取已知含量（批號161231）的多動安口服液2 mL 6份，置于10 mL容量瓶中，分別精密加入相同量的芍藥苷對照品，按供試品溶液制備方法制備，分別精密吸取10 uL，測定峰面積，按回歸方程計(jì)算含量，計(jì)算回收率，平均回收率為9723%，RSD 為874%，結(jié)果見表4。

2.3.9.樣品測定取批號161231的多動安口服液，按供試品溶液制備方法制備，在上述色譜條件下，進(jìn)樣10 uL，測定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果樣品中芍藥苷的含量為01410 mg/mL。

3 討論

3.1.疳積合劑

3.1.1.威靈仙的鑒別在威靈仙薄層鑒別實(shí)驗(yàn)探索過程中，曾參照王曙等人在華西藥學(xué)雜志上發(fā)表的文章，威靈仙的薄層色譜鑒別中威靈仙供試品溶液制備方法，取疳積合劑20 mL，用10 %硫酸溶液30 mL溶解，沸水浴水解2 h，氯仿萃取2 次，每次30 mL，合并萃取液，濃縮至干，用氯仿1 mL溶解殘?jiān)?，制成供試品溶液[11]。參照2015版藥典記錄的威靈仙供試品溶液制備方法[5]，制備威靈仙對照藥材溶液，以氯仿-石油醚（5∶10）為展開劑，噴10 %磷鉬酸乙醇試液，105 ℃加熱，結(jié)果供試品溶液、對照藥材溶液均未出現(xiàn)斑點(diǎn)。

供試品未出現(xiàn)斑點(diǎn)，分析原因可能是10%硫酸溶液酸性較小，不能使疳積合劑中威靈仙皂苷完全水解。對照藥材未出現(xiàn)斑點(diǎn)，分析原因可能是用10mL無水乙醇溶解殘留物，濃度較小。還有可能是展開劑極性較小所致。

根據(jù)2015版藥典記錄的威靈仙供試品溶液制備的取樣量1 g，醫(yī)院制劑疳積合劑威靈仙投藥90 g，最終制成1000 mL。通過計(jì)算，取樣疳積合劑11 mL相當(dāng)于取樣威靈仙藥材1 g。供試品溶液制備探索過程中，考慮到制劑工藝的特殊性，第一次取樣量擴(kuò)大10倍，即取樣疳積合劑110 mL，改用濃鹽酸使其水解，其他同“111供試品溶液的制備”項(xiàng)下制成供試品溶液。威靈仙對照藥材溶液制備用乙醇提取，濃鹽酸使其水解，石油醚萃取，殘留物用無水乙醇1 mL溶解，并以極性更大的甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20∶3∶02）為展開劑。使用改變后的薄層條件，105℃加熱至斑點(diǎn)清晰，自然光下檢視，結(jié)果見圖6。

第2次取樣量擴(kuò)大5倍，即111項(xiàng)下的供試品溶液。點(diǎn)樣過程中，分別考察了陰性對照液-供試品液-對照藥材溶液-對照品溶液不同點(diǎn)樣量（10 uL，10 uL，10 uL，10 uL;25 uL，25 uL，20 uL，10 uL;50 uL，50 uL，30 uL，10 uL），結(jié)果表明采用50 uL，50 uL，30 uL，10 uL的點(diǎn)樣量，各斑點(diǎn)清晰，見圖1。理論上，再應(yīng)將取樣量擴(kuò)大4倍、3倍、2倍等依次制備供試品溶液，相同薄層色譜條件，考察供試品能否與對照藥材、對照品在色譜相應(yīng)位置出現(xiàn)相同紫紅色斑點(diǎn)。由于實(shí)驗(yàn)時間限制，未能繼續(xù)探索。

3.1.2.使君子的鑒別由于使君子藥材中含沒食子酸，所以參照2015版藥典記錄的鐵笛口服液[13]供試品溶液的制備方法，用乙酸乙酯振搖提取，棄去乙酸乙酯液，水液用水飽和的正丁醇振搖提取，合并正丁醇液，蒸干，殘留物用甲醇溶解，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸-水（7∶3∶1∶05）為展開劑，以10%三氯化鐵乙醇溶液為顯色劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒食子酸對照品溶液出現(xiàn)深藍(lán)色斑點(diǎn)，供試品溶液未出現(xiàn)清晰斑點(diǎn)，見圖6。

分析原因該制劑的制備工藝中采用水提取，理論上制劑中含有沒食子酸，但使君子中化學(xué)成分多，另外疳積合劑中藥味較多，化學(xué)成分更多、更復(fù)雜，用上述供試品溶液制備方法難以提取出沒食子酸。

2015版藥典規(guī)定，使君子藥材中含葫蘆巴堿不得少于020%，用乙醚分別超聲提取疳積合劑、使君子藥材，濾液蒸干，殘?jiān)靡宜嵋阴ト芙?，分別得到供試品溶液和對照藥材溶液，以石油醚（30℃～60℃）-乙酸乙酯為展開劑，10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，結(jié)果對照藥材溶液出現(xiàn)灰色清晰斑點(diǎn)，供試品溶液在相同位置未出現(xiàn)斑點(diǎn)。分析原因該制劑為水提液，制劑中脂溶性成分含量偏低，用乙醚提取疳積合劑，供試品溶液中使君子脂溶性成分含量更低，所以在薄層鑒別時，供試品溶液斑點(diǎn)顯色不明顯。疳積合劑中使君子的薄層色譜中不成功，還有待繼續(xù)探索研究。

3.2.多動安口服液中芍藥苷的含量測定本次實(shí)驗(yàn)所選儀器是高效液相與質(zhì)譜連用，為了不影響以后質(zhì)譜儀的使用情況，高效液相儀避免使用鹽類流動相。所以分別考察了甲醇-01%磷酸（30∶70），甲醇-水不同比例（25∶75∶35∶65），結(jié)果表明采用甲醇-水（25∶75）時所得到的色譜圖基線平穩(wěn)，且樣品中芍藥苷前后之間的峰分離較好，見圖4。因此選用甲醇-水（25：75）為多動安口服液中芍藥苷的含量測定的流動相。

在加樣回收率實(shí)驗(yàn)中，平均回收率為9723%，屬于正常值，但RSD值為874%，值較大，表明回收率的精度較低。分析原因是在最后兩針進(jìn)樣時，儀器柱壓明顯升高所致。

根據(jù)醫(yī)院制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高的要求，應(yīng)對同一制劑多個批次進(jìn)行研究，由于時間限制，以上制劑均只做了一個批次的實(shí)驗(yàn)研究，在后期的實(shí)驗(yàn)中，會不斷研究多個批次，然后匯總數(shù)據(jù)，進(jìn)行分析，以準(zhǔn)確提高醫(yī)院制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

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