寡聚脫氧核苷酸協(xié)同扶正清解方抗肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用

周曉晶，李 晶，明容美，于江波，王永彬，邢日新，孫 鵬

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130017； 2.吉林省人民醫(yī)院，長(zhǎng)春 130021；3.吉林敖東藥業(yè)股份有限公司，吉林 敦化 133700）

原發(fā)性肝癌具有高發(fā)病率、高病死率的特點(diǎn)[1]，腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是其主要危險(xiǎn)因素[2]?；诋?dāng)下原發(fā)性肝癌根治率相對(duì)較低、復(fù)發(fā)率高及易轉(zhuǎn)移的現(xiàn)狀，中醫(yī)中藥在腫瘤的防治中已凸顯成效[3-4]。根據(jù)“扶正兼祛邪”的原則，扶正清解方具有益氣養(yǎng)陰、消癰散結(jié)及抗腫瘤多種功效，臨床上被用于消化系統(tǒng)腫瘤的輔助治療[5-8]。本研究基于扶正清解方中各組分的不同抗腫瘤作用和自主設(shè)計(jì)的寡聚脫氧核苷酸（Oligodeoxynucleotide ODN）的誘導(dǎo)天然免疫、協(xié)同抗腫瘤作用[9-12]，旨在利用ODN誘導(dǎo)的天然免疫[13-15]和扶正清解方的多靶點(diǎn)作用相互協(xié)調(diào)，從而達(dá)到抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的目的，為臨床治空治肝癌的轉(zhuǎn)移提供思路和理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)藥品：扶正清解方，成分：黃芪30 g，女貞子15 g，夏枯草15 g，白花蛇舌草30 g，靈芝30 g，淮山藥15 g。購(gòu)自長(zhǎng)春同仁堂藥店，藥物質(zhì)量符合中華人民共和國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)。以上藥物在水中浸泡30 min，水提，合并濾液，抽真空過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿，于蒸發(fā)皿上揮干，于真空干燥箱進(jìn)行干燥。加入IMDM培養(yǎng)液配成（生藥含量2.66 g/mL），于- 20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；ODN，由上海生物工程公司合成，溶解稀釋保存于-20 ℃冰箱備用。細(xì)胞：人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株液氮冷凍儲(chǔ)存，為懸浮生長(zhǎng)，使用10% FBS IMDM 培養(yǎng)于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MTT法檢測(cè)HepG2細(xì)胞增殖 用胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，用10% FBS IMDM制備成單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中（4×104個(gè)/mL），于CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)過夜。設(shè)置各組，37 ℃培養(yǎng) 12、24、36、48、60、72 h。在檢測(cè)前4 h加入 MTT溶液（5 mg/mL，20 μL/孔），4 h 后吸棄上清液， 且每孔加入 150 μL 二甲亞砜溶解沉淀，振蕩 10 min，用酶標(biāo)儀在 570 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度（OD 值）。計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。抑制率=（1 －給藥組 OD 值/對(duì)照組OD 值）×100%。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，抑制率值為縱軸繪制細(xì)胞增殖抑制時(shí)效關(guān)系曲線。

2.2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2細(xì)胞遷移能力 用胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，用10% FBS IMDM制備成單細(xì)胞懸液，接種于6孔板（1×106個(gè)細(xì)胞/孔），37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸掉培養(yǎng)液，PBS進(jìn)行2次洗滌，用加樣器頭沿著培養(yǎng)板底部劃“一”字形痕跡，再次用PBS洗去未貼壁細(xì)胞，然后按組加入成分不同的培養(yǎng)液。記錄加入不同培養(yǎng)液0 h劃痕間距，于24 h觀測(cè)劃痕間距。用如下公式進(jìn)行計(jì)算遷移率：n h細(xì)胞遷移率= [1－邊緣距離（nh）/邊緣距離（0h）]×100%。[16]

2.3 Transwell小室檢測(cè)HepG2細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力 在transwell上室涂1 mg/mL的Matrigel凝膠，37 ℃溫育30 min。取用低血清IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h的HepG2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106/mL，取100 μL細(xì)胞接種于transwell上室，對(duì)照組加入等體積無(wú)血清IMDM培養(yǎng)液；transwell下室加入含15% FBS的IMDM培養(yǎng)液600 μL， 37℃、5% CO2 培養(yǎng) 24 h，然后吸去上室的培養(yǎng)液，利用100%甲醇固定細(xì)胞20 min，吸去甲醇，PBS清洗2次。然后避光，用Giemsa染色15 min，將Giemsa吸去，PBS洗滌2次，用棉簽?zāi)ㄈV膜上層未穿過膜的細(xì)胞并風(fēng)干，在光鏡下記錄膜背面細(xì)胞數(shù)，在膜上下左右中5個(gè)不同視野（×40）取平均值，按如下公式計(jì)算各組HepG2細(xì)胞的侵襲率。侵襲抑制率=（1 －加藥組平均侵襲細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組數(shù)平均侵襲細(xì)胞數(shù)）×100%。[17]

3 結(jié)果

3.1 ODN協(xié)同扶正清解方對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用 MTT 實(shí)驗(yàn)表明：ODN +扶正清解方組的HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)在第24 h開始受到抑制，其細(xì)胞增值能力明顯低于對(duì)Medium組及單獨(dú)ODN組（P＜0.05），見圖1（見插頁(yè)四）。說明ODN可協(xié)同扶正清解方抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)。

3.2 ODN協(xié)同扶正清解方對(duì)HepG2細(xì)胞遷移的抑制作用 遷移實(shí)驗(yàn)提示，ODN+扶正清解方組的肝癌細(xì)胞與對(duì)照組相比，更少的細(xì)胞發(fā)生了遷移（P＜0.05），見圖 2（見插頁(yè)四）。說明ODN可協(xié)同扶正清解方抑制HepG2細(xì)胞遷移。

3.3 ODN協(xié)同扶正清解方對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲的抑制作用 Transwel實(shí)驗(yàn)顯示，ODN+扶正清解方組HepG2細(xì)胞加入Transwel上室以后24 h，穿過Matrigel 膠的細(xì)胞數(shù)目顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），見圖3（見插頁(yè)四）。說明ODN可協(xié)同扶正清解方抑制HepG2細(xì)胞侵襲。

4 結(jié)語(yǔ)

肝癌細(xì)胞的高轉(zhuǎn)移侵襲性是肝癌高危性的重要原因，臨床研究表明，中醫(yī)藥在防止腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移、提高患者的免疫系統(tǒng)功能、抑制腫瘤生長(zhǎng)及腫瘤血管的生成、延緩患者的生命和提高生活質(zhì)量等方面發(fā)揮著重要作用。扶正清解是由扶正抑瘤方和解毒消癃飲派生出來的[18]。扶正抑瘤方由黃芪、女貞子、靈芝、淮山藥組成。解毒消瘸飲由白花蛇舌草、夏枯草、山慈菇和苦參組成。方中黃芪、女貞子具有益氣養(yǎng)陰作用，為君藥；配以靈芝、山藥，取其扶正培本之功，為臣藥，夏枯草、白花蛇舌草具有苦寒，具有清熱解毒、消癰散結(jié)作用，為佐使藥[19]。研究發(fā)現(xiàn)，方中的各味藥在消化系統(tǒng)腫瘤中均可起到不同的作用。而且前期研究發(fā)現(xiàn)自主設(shè)計(jì)的ODN具有活化天然免疫作用，能夠輔佐乙肝表面抗原抑制對(duì)小鼠肝癌具有明顯抑制作用[20]。本研究在扶正清解方的基礎(chǔ)上輔以自主設(shè)計(jì)的ODN，研究其對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ODN可協(xié)助扶正清解方抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移。說明兩者聯(lián)合應(yīng)用可多靶點(diǎn)抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，可為肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和研究思路。