四氯化碳致小鼠急性肝損傷模型造模要素及中醫(yī)藥防治的數(shù)據(jù)挖掘研究

胡鳳嬌，宋文杰，王張，梁源，劉光麗

肝病是威脅我國(guó)人民健康的重大疾病之一，具有發(fā)病率高、病程長(zhǎng)、難以徹底治愈、病情反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)。肝病的對(duì)癥藥物治療是臨床上的常用手段，肝病種類很多，多會(huì)引起肝臟炎癥，致不同程度的肝損傷，因此肝損傷動(dòng)物模型在肝病機(jī)理研究及藥物研發(fā)中非常重要。CCL4是常見(jiàn)的制作肝損傷動(dòng)物模型的造模試劑，其成模率高、重復(fù)性好。因文獻(xiàn)報(bào)道的造模參數(shù)參差不齊，相差過(guò)大，導(dǎo)致模型的成功率差異很大，故本文對(duì)國(guó)內(nèi)20多年來(lái)利用CCL4致小鼠肝損傷動(dòng)物模型的造模要素及其中醫(yī)藥防治的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘和分析，為提高造模效率及評(píng)價(jià)中醫(yī)藥防治肝損傷疾病的療效提供定量的方法學(xué)參考。

1 材料

在中國(guó)知識(shí)基礎(chǔ)設(shè)施工程(CNKI)、維普數(shù)據(jù)庫(kù)中，收集1990年-2016年期間（27年）研究CCL4致小鼠肝損傷動(dòng)物模型的文獻(xiàn)，對(duì)文獻(xiàn)的完整程度、應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，最終納入393篇文章。

2 方法

2.1 信息錄入

應(yīng)用Excel軟件，錄入文章題目，動(dòng)物種別、體重、性別，四氯化碳所用稀釋液、濃度、給予量、給予部位、給予次數(shù)，造模與給藥先后關(guān)系，造模后處死間隔，受試藥物名稱、藥物組成、陽(yáng)性藥，肝組織取材部位、肝組織病理描述，測(cè)試指標(biāo)等信息。

2.2 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建

制作《CCL4致小鼠急性肝損傷的造模要素?cái)?shù)據(jù)挖掘表》。

2.3 統(tǒng)計(jì)和分析

對(duì)錄入的每項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，定量歸納造模要素。

3 結(jié)果

3.1 動(dòng)物

3.1.1 種別 多為KM小鼠，極少數(shù)使用ICR小鼠。

3.1.2 性別 主要為雄性。其原因可能是男性生活壓力較大，經(jīng)常熬夜、酗酒、工作疲勞，且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，雄性鼠對(duì)黃曲霉毒素等致癌物更加敏感，更容易發(fā)生肝癌。

3.1.3 購(gòu)進(jìn)時(shí)體重 最常使用的體重為20±2 g（61.83%，意為納入文章中出現(xiàn)的頻率，后同），其次為22±2 g（4.58%）、19±1 g（3.82%）、22.5±2.5 g（3.56%）等。

3.2 造模

3.2.1 四氯化碳的稀釋液 常用者為花生油（41.73%）、橄欖油（18.58%）、豆油（7.13%）、植物油（5.85%）、色拉油（3.05%）、液體石蠟（2.80%）等。

3.2.2 四氯化碳的稀釋濃度 常見(jiàn)者為0.1%（35.62%）、0.2%（13.49%）、0.15%（7.12%）、1%（7.12%）、0.5%（6.87%）、0.08%（4.83%）、10%（4.07%）等。

3.2.3四氯化碳的給予體積 常見(jiàn)者為10 mg﹒kg-1（67.68%）、20 mg﹒kg-1（8.65%）、5 mg﹒kg-1（8.40%）、2 mg﹒kg-1（1.27%）等。

3.2.4 四氯化碳的給予劑量 常見(jiàn)者為0.01 mg﹒kg-1（27.74%）、0.02 mg﹒kg-1（15.52%）、0.05 mg﹒kg-1（8.14%）等。

3.2.5 四氯化碳給予部位 常見(jiàn)者為腹腔注射（84.73%）、灌胃（8.40%）、皮下注射（6.11%）。

3.2.6 四氯化碳給予次數(shù) 絕大多數(shù)文獻(xiàn)選擇一次性給予造模（95%）。

3.2.7 造模后動(dòng)物處死時(shí)間 多在12～24 h之間，最常見(jiàn)者為24 h（30.28%）、16h（27.23%）、18h（9.16%）、20h（5.85%）、12h（5.09%）。因此階段處于肝損傷巔峰期，處死時(shí)間太短，肝損傷不完全；時(shí)間太長(zhǎng)，已經(jīng)造成的肝損傷開(kāi)始修復(fù)。

3.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)

3.3.1 常見(jiàn)生化指標(biāo) 詳見(jiàn)表1。造模成功后，血清中的ALT、AST、MDA、肝指數(shù)、TNF-α、ALP、NO、LDH、TG、TBIL、IL-6、TGF-β1、NF-κB、IL-1β均上升，SOD、GSH-PxGSH、CAT、ALB、T-AOC、TP、P450、Cytκ.b5、IL-10均下降。ALT、AST是肝臟功能的重要檢測(cè)指標(biāo)，其變化與肝臟受損程度成正相關(guān)。

表1 指標(biāo)及其變化趨勢(shì)

核因子 NF-κB ↑ 3 ↓ 3白介素-10 IL-10 ↓ 3 ↑ 3白介素-1β IL-1β ↑ 3 ↓ 3白介素-2 IL-2 ↑ 2 ↓ 2一氧化氮合酶 NOS ↑ 2 ↓ 2細(xì)胞色素 Cyt.b5 ↓ 2 ↑ 2肝糖原 —— ↑ 1 ↓ 1↓1↑1肝臟蛋白 —— ↓ 2 ↑ 2肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 HGF ↓ 2 ↑ 2細(xì)胞間黏附分子 1ICAM-1/CD54↑2↓2谷胱甘肽還原酶 GR ↓ 2 ↑ 2總膽固醇 TC ↑ 2 ↓ 2膽堿酯酶 ChE ↓ 2 ↑ 2肝功能白球比例 (A/G) ↓ 2 ↑ 2 caspase-3 —— ↑ 2 ↓2谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 GGT ↑ 2 ↓ 2 β-半乳糖苷酶 β-Gal ↑ 1 ↓ 1硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物 TBARS ↑ 1 ↓ 1膽紅素 BIL ↑ 1 ↓ 1肝藥酶 —— ↓ 1 ↑ 1游離脂肪酸 FFA ↑ 1 ↓ 1肝指酶 HL/HTGL↑ 1 ↓ 1球蛋白 GLB/G - 1 - 1山梨醇脫氫酶 SDH ↑ 1 ↓ 1血尿素氮 BUN ↑ 1 ↓ 1白介素-8 IL-8 ↑ 1 ↓ 1脂質(zhì)過(guò)氧化物 LOOH ↑ 1 ↓ 1肝細(xì)胞人體抑癌基因 P53 ↑ 1 ↓ 1 Toll樣受體 TLR4 ↑ 1 ↓ 1直接膽紅素 DBIL ↑ 1 ↓ 1肝再生增強(qiáng)因子 ALR ↓ 1 ↑ 1羥脯氨酸 Hyp ↑ 1 ↓ 1 Bcl-2相關(guān)x蛋白 Bax ↑ 1 ↓ 1淋巴細(xì)胞瘤一2蛋白 Bel-2 ↓ 1 ↑ 1

3.3.2 其它不常見(jiàn)生化指標(biāo) 詳見(jiàn)表1。IL-2、NOS、Cyt.b5、肝糖原、肝臟蛋白、HGF、CD54、GR、TC、ChE、A/G、caspase-3、GGT、β-Gal、TBARS、BIL、肝藥酶、FFA、HL/HTGL、GLB、SDH、BUN、IL-8、LOOH、P53、TLR4、DBIL、ALR、Hyp、Bax、Bel-2等。

3.3.3 肝組織變化

3.3.3.1肝組織取材部位 大多數(shù)取整肝，其余取材部位包括肝左葉、肝右葉、最大肝葉以及肝小葉。

3.3.3.2 肝組織外觀大體描述 正常組小鼠的肝臟結(jié)構(gòu)正常，外觀呈紅褐色，質(zhì)地軟而富有彈性，無(wú)變性，壞死等病理變化；模型組小鼠的肝臟常表現(xiàn)為質(zhì)地較脆，顏色灰暗，表面粗糙有許多結(jié)節(jié)，肝臟明顯腫大，淤血，肝臟表面有點(diǎn)狀出血。

3.3.3.3 肝組織病理學(xué) 以肝細(xì)胞壞死以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)最為常見(jiàn)，其它病變包括水樣病變、氣球樣病變、肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂、脂肪形變、肝細(xì)胞索排列紊亂、肝臟表面病變等。

3.4 藥物防治

3.4.1 給藥方案 平均為14天。給藥時(shí)間常見(jiàn)者有先給藥后造模（79.64%）、造模同時(shí)給藥（11.96%）、先造模后給藥（5.60%）、僅造模（2.04%）、先給藥后造模給藥再同時(shí)進(jìn)行（0.25%）。

3.4.2 陽(yáng)性對(duì)照藥 主要有聯(lián)苯雙酯（49.36%）、水飛薊素（7.89%）、甘利欣（2.80%）、維生素E（1.02%）、益肝靈片（1.02%）、馬洛替酯（0.51%）、谷胱甘肽（0.51%）、護(hù)肝片（0.51%）、肝泰樂(lè)（0.51%）、秋水仙堿片（0.25%）等。

3.4.3 中藥

3.4.3.1 復(fù)方制劑 包括梔子柏皮湯、降脂利肝方、復(fù)方丹參注射液、復(fù)方苦參沖劑、朝醫(yī)方、二門(mén)五味湯、八味獐牙菜散、柴芩清肝膠囊等。

3.4.3.2 中藥材 涉及96種中藥材（括號(hào)內(nèi)為文章篇數(shù)），即黃芪（17）、甘草（16）、丹參（14）、茵陳（14）、柴胡（13）、黃芩（13）、五味子（10）、梔子（9）、白花蛇舌草（7）、決明子（7）、郁金（7）、大青葉（7）、白術(shù)（6）、靈芝（6）、炒白術(shù)（6）、虎杖（5）、三七（5）、黨參（4）、白芍（4）、澤瀉（3）、紫草（3）、金錢(qián)草（3）、大棗（3）、葛根（3）、山楂（3）、垂盆草（3）、龍膽（3）、鱉甲（3）、絞股藍(lán)（3）、胡黃連（2）、大黃（2）、黃柏（2）、小田基黃（2）、半枝蓮（2）、生姜（2）、木香（2）、何首烏（2）、山豆根（2）、雞血藤（2）、女貞子（2）、香附（2）、馬鞭草（2）、何首烏（2）、石見(jiàn)穿（2）、川芎（2）、赤芍（2）、石斛（2）、波棱瓜子（2）、麥冬（2）、茯苓（2）、焦山楂（2）、雞內(nèi)金（1）、海金沙（1）、板蘭根（1）、清半夏（1）、麥芽（1）、陳皮（1）、防風(fēng)（1）、八月扎（1）、云芩（1）、荷葉（1）、桃仁（1）、陸英（1）、牡丹皮（1）、小花清風(fēng)藤（1）、仙靈脾（1）、貓爪草（1）、延胡索（1）、土茯苓 （1）、薤白（1）、蚤休（1）、車前草（1）、焦麥芽（1）、焦神曲（1）、法半夏（1）、烏梅（1）、紅參（1）、苦參堿（1）、太子參（1）、葉下珠（1）、刺梨汁粉（1）、六月雪（1）、雞骨草（1）、牛黃（1）、蒼術(shù)（1）、降香（1）、天門(mén)冬（1）、芍藥（1）、獐芽菜（1）、唐古特烏頭（1）、矮叢風(fēng)毛菊（1）、短管兔兒草（1）、節(jié)裂角茴香（1）、小檗皮（1）、菊花（1）、桔梗（1）。

3.4.3.3 黃酮類 包括紫心甘薯總黃酮、玉郎傘黃酮、野菊花總黃酮、小葉黑柴胡莖葉總黃酮、相思藤總黃酮、忍冬葉總黃酮、馬鞭草總黃酮、雞血藤總黃酮、黃蜀葵花黃酮、黃芩莖葉總黃酮、紅景天總黃酮、葛根總黃酮、甘草類黃酮、杜仲總黃酮、大豆異黃酮、大豆異黃酮、穿破石總黃酮、白花蛇舌草黃酮、銀杏葉提取物等。

3.4.3.4 苷類 包括白首烏C21甾體酯苷、紫丁香苷、竹節(jié)參總皂苷、特女貞苷、羥基積雪草苷、木通皂苷D、毛蕊花苷固體脂質(zhì)納米粒、芒果苷滴丸、羅漢果甜苷、京尼平甙、黃芩苷、黃苠總甙、鬼針聚炔苷、大豆皂苷、橙皮苷等。

3.4.3.5 多糖類 包括窯歸多糖、羊肚菌胞內(nèi)多糖、仙人掌多糖、鐵棍山藥多糖、酸棗多糖、肉蓯蓉多糖、龍葵多糖、殼寡糖I和殼寡糖Ⅱ、蕨麻多糖、金頂側(cè)耳多糖、絞股藍(lán)多糖、姬松茸多糖、霍山石斛多糖、灰樹(shù)花多糖、黃芪多糖、花生粗多糖、歸芪多糖、大棗多糖、純化當(dāng)歸多糖、北五味子粗多糖、蚌肉多糖等。

3.4.4 有效性評(píng)價(jià)指標(biāo) 詳見(jiàn)表1。給藥后，血清及肝臟中的ALT、AST、MDA、肝指數(shù)、TNF-α、ALP、NO、LDH、TG、TBIL、IL-6、TGF-β1、NF-κB、IL-1β均上升。給藥組小鼠的肝臟損傷（外觀和鏡下）程度均有不同程度的減輕，且存在劑量依賴性。

4 討論

研究表明，肝損傷的基本要素為細(xì)胞死亡。細(xì)胞死亡又分為壞死和凋亡。細(xì)胞壞死是細(xì)胞生物膜系統(tǒng)的完整性被破壞，導(dǎo)致胞質(zhì)液的酶類釋出（如：ALT、AST），激起炎癥反應(yīng)，炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子、毒性氧基團(tuán)的出現(xiàn)會(huì)進(jìn)一步損傷鄰近組織。細(xì)胞凋亡則不會(huì)引起炎癥反應(yīng)，但可以激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β，促進(jìn)纖維化，凋亡的本質(zhì)雖為機(jī)體保證正常細(xì)胞轉(zhuǎn)換的生理過(guò)程，但凋亡過(guò)多或過(guò)少均可造成病理現(xiàn)象。壞死和凋亡的共同之處在于線粒體結(jié)構(gòu)的改變，失去功能。線粒體功能衰竭形成壞死；線粒體釋放出一些凋亡誘發(fā)因子造成凋亡。外來(lái)毒素或有害因子劑量較低時(shí)，以凋亡為主，劑量較高時(shí)，以壞死為主。但不十分絕對(duì)，在考慮治療方案時(shí)，應(yīng)同時(shí)采取防止和阻斷壞死與凋亡雙管齊下的方針。

而本文未將小鼠肝組織病變程度與給予劑量進(jìn)行相關(guān)性分析，若結(jié)合分析，預(yù)計(jì)可通過(guò)控制四氯化碳的給予劑量進(jìn)而控制肝臟的損傷病變程度，真正達(dá)到定量造模的要求。