質譜技術在肺癌分子標志物探究中的近期應用

荊心研，盧兆蓮，張 婷，胡成進，李傳海

肺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，肺癌的發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中位居前列［1，2］，其病死率高的主要原因是早期癥狀不明顯，就診時大多已處于中晚期，失去最佳的診療時機。在Ⅰ期肺癌中經手術治療的患者5年生存率為54%，而未經任何治療的患者5年生存率僅為6%［3］。因此，早診斷、早治療是提高5年生存率、改善患者生活質量、降低病死率的關鍵。腫瘤標志物與低劑量計算機斷層掃描、痰液細胞學等結合可提高肺癌的早期診斷率［4］。肺癌分子標志物成為肺癌研究的重點之一，而利用質譜技術對腫瘤標志物進行研究是目前的熱點之一。

1 質譜技術概述

1.1 質譜儀簡介質譜儀由進樣裝置、離子化源、質量分析器、離子檢測器和數據分析系統(tǒng)組成，其中質量分析器是該技術的核心［5］。目前，主要的生物質譜技術包括電噴霧離子化（electrospray ionization，ESI）和基質輔助激光解吸離子化質譜，前者一般與四極桿、離子阱質量分析器結合，分別組成電噴霧-四極桿質譜、電噴霧-離子阱質譜；而后者常與飛行時間質譜結合，組成基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDITOF-MS）。MALDI-TOF-MS通常用于分析相對簡單的肽混合物，而綜合液相色譜ESI-MS系統(tǒng)（LCMS）首選用于分析復雜的樣品［5］。

1.2 數據分析對實驗獲得的數據進行分析，是質譜分析的重要步驟之一。不同的研究需要不同的數據分析系統(tǒng)，如蛋白質組學的研究，可以通過數據庫搜索、生物統(tǒng)計分析、從頭測序、翻譯后修飾驗證等進行數據分析，各個方法都有其各自相應的應用軟件［6］。

1.3 應用優(yōu)勢質譜分析技術具有敏感度高、特異性好、分析方式靈活等優(yōu)點，能夠實現在體、實時、在線、高通量的測試和分析［7］。質譜技術的飛速發(fā)展及日趨成熟使其逐漸從基礎醫(yī)學的研究轉向輔助臨床診斷。目前很多具備條件的臨床實驗室引進質譜儀用于臨床樣本的檢測，例如MALDI-TOF-MS已成功進入臨床微生物學實驗室，成為細菌鑒定領域突破性的技術［8］。

2 質譜在肺癌分子標志物中的探究

肺癌在發(fā)生細胞形態(tài)學改變 （如異型細胞）之前，已伴隨亞細胞層次的改變，而細胞和亞細胞層次改變之前發(fā)生的是分子水平的改變［7］。這些改變可導致血液、痰液、呼出氣、肺泡灌洗液、組織、尿液、唾液等生物樣品中相應分子水平的改變。目前許多學者利用上述各種標本結合質譜技術對肺癌特異性的分子標志物進行了相關實驗研究，為肺癌的診斷提供新方法。

2.1 血漿/血清血漿/血清是輔助檢查中常用的樣本，在肺癌分子標志物的質譜分析研究中應用廣泛。Hanas等［9］將Ⅰ期非小細胞肺癌患者、肺良性結節(jié)患者、健康體檢者的血清用電噴霧質譜法在質荷比為450～1500范圍內獲得所有質譜峰，并創(chuàng)建數據集，根據留一交叉驗證法分析數據，該數據集中將健康對照者與肺癌患者、肺良性結節(jié)患者鑒別的敏感性分別為89%、83%，而Ⅰ期肺癌患者與肺良性結節(jié)患者鑒別的敏感性為80%，假設生物分子及其在血清中的量反映了個體的特定生理/疾病狀態(tài)，那么該實驗有利于開發(fā)篩查工具用以輔助鑒別肺癌高風險患者和肺良性結節(jié)患者。安娟等［10］用銅離子螯合納米磁珠提取非小細胞肺癌患者和健康者血清中的多肽，用MALDI-TOF-MS技術進行質譜并用統(tǒng)計軟件分析，建立非小細胞肺癌的血清多肽分類模型，待大規(guī)模驗證后該模型可用于協(xié)助肺癌早期診斷。

質譜技術在脂質代謝組學方面對肺癌分子標志物的探究也存在巨大研究前景。Ren等［11］將487名健康對照者、479例肺良性疾病患者、474例肺癌患者的血清提取脂質后，利用基質輔助激光/解吸電離-傅立葉變換離子回旋共振質譜 （MALDI-FTICR MS）進行的分析表明與肺部良性疾病相比，肺癌患者 中 的 C16：0、C16：1、C18：0、C18：1、C18：3、C20：3、C22：6升 高 ，C20：5水平下降，并建立了三個脂質組合：組合 a（C18：2、C20：3、C20：4、C20：5、C22：5、C22：6）， 組 合 b （C18：0、C20：4、C20：5、C22：6）和組合 c（C16：1、C18：0、C18：1、C20：3、C22：6），比較發(fā)現，在肺部良性疾病與肺癌的鑒別中這三個組合比臨床應用的腫瘤標志物（CEA和Cyfra21-1）具有更好的診斷能力。

2.2 痰液痰液中含有脫落的上皮細胞，其細胞學分析已經用于肺癌的輔助診斷［12］。Zhang 等［13］利用中性解吸提取電噴霧離子化質譜（ND-EESI-MS）技術對非小細胞肺癌患者、健康人以及肺部良性疾病患者的清晨痰標本進行實驗，將獲得的數據進行主成分分析，發(fā)現質譜峰 m/z 734、756、772、798、803、818為區(qū)分肺癌組與對照組的主要譜峰。其中m/z 734、756、772經碰撞誘導解離后分別被證實為［DPPC+H］+、［DPPC+Na］+、［DPPC+K］+，而 m/z 798、803分別為磷脂酰甘油、磷脂酰甘油磷酸酯。利用質譜技術尋找肺癌患者痰液中的特異性分子，可為肺癌的診斷提供豐富、有效的信息。

2.3 呼出氣體呼出氣體主要由氮氣、氧氣、二氧化碳、水汽和惰性氣體及痕量組分組成，其中痕量組分由體內產生或從外界環(huán)境中吸收的揮發(fā)性氣體組成［14］。呼氣分析具有識別反映各種呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病機制炎癥標記的潛力，目前質譜已經應用于呼出氣中揮發(fā)性和非揮發(fā)性物質的分析［15］。呼氣分析可以在氣相中進行，也可以在液相——呼出氣冷凝液中進行［15］。呼出氣的分析主要依靠氣相色譜-質譜分析法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）。 Dallinga 等［16］利用 GS-MS 對正常人呼出氣中的揮發(fā)性有機化合物進行實驗方法的探究及分析，得到正常呼出氣的組成成分，為呼出氣的質譜研究奠定了基礎。Filipiak等［17］將肺癌患者與健康對照者的呼出氣濃縮處理后結合GC-MS分析研究，檢測到癌癥患者中濃度較高的揮發(fā)性有機化合物有23種，其中最重要的是正辛烷、壬烷和2，3-丁二酮；同時將呼出氣、手術切除的肺癌組織、肺腫瘤細胞株分別進行對比實驗，發(fā)現這三種類型的標本中檢出的化合物有較高的一致性。Peralbo-Molina等［18］對肺癌患者、肺癌高風險患者及健康對照者的呼出氣冷凝液進行氣相色譜－飛行時間質譜 （GCTOF/MS）實驗，將三組分別進行兩兩對照實驗，發(fā)現肺癌組與高風險組比較，存在4種有差異的化合物；肺癌組與健康對照組相比較存在3種有差異的化合物；高風險組與健康對照組比較存在5種有差異的化合物。這些化合物相互結合為肺癌鑒別診斷提供依據。對呼出氣的實驗研究考慮呼出氣中可能存在某些化合物也可以輔助診斷肺癌，但目前尚未在呼出氣中發(fā)現臨床意義明確的腫瘤標志物，需要進一步深入研究。

2.4 肺泡灌洗液對于胸部X線片異常的可疑肺癌患者進行光纖支氣管鏡檢查，通過支氣管清洗、支氣管毛刷或支氣管肺泡灌洗液進行活組織檢查和（或）細胞學檢測明確診斷［19］。肺泡灌洗液中含有大量脫落細胞、腫瘤凋亡細胞、壞死細胞及腫瘤分泌或釋放的特異性或非特異性蛋白質分子，為肺癌的早期診斷提供了新思路［20］。 周繼紅等［20，21］利用表面增強激光解析電離飛行時間質譜技術將周圍型肺癌患者的血清與支氣管活檢肺泡灌洗液進行對比，發(fā)現肺泡灌洗液中的差異蛋白較血清中多，利用肺泡灌洗液建立分類診斷模型的診斷效率較血清高，可篩查出差異性蛋白作為診斷肺癌的腫瘤標志物。Paster等［22］將對照組、肺癌組、慢性阻塞性肺疾病（COPD）組及肺癌合并COPD患者各15例的肺泡灌洗液先進行二維凝膠電泳，找出差異蛋白，用MALDI－TOF/TOF鑒定，找到15種與氧化應激相關的蛋白，并得出轉錄因子NF－κB作用于氧化應激蛋白之間參與氧化應激反應通路，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，為肺癌和COPD的診斷提供新的標志物和預測工具。Carvalho等［19］收集2014年4月—7月90例可疑肺癌患者的肺泡灌洗液用液相色譜－質譜聯(lián)用儀（LC－MS）分析，經2年的隨訪研究，將患者2014年6月和8月分別與之前進行評估對比，發(fā)現了病例組與對照組之間存在133種差異表達蛋白，將這些差異表達蛋白與文獻報道的差異表達蛋白進行比較、總結，為診斷肺癌提供有意義的實驗依據。雖然肺泡灌洗液對肺癌診斷的敏感性較低（29%～69%），但其特異性高（90%～100%）的優(yōu)點不容忽視［19］。

2.5 肺組織肺組織作為信息量最多的標本，在疾病的診斷中具有重要的意義。Li等［23］將肺鱗癌組織與癌旁組織分別磨成粉末后溶于勻漿緩沖溶液后提取膜蛋白，用SDS－PAGE初步分離并進行2－DE，選擇差異明顯的蛋白質斑點進行MALDI－TOF，發(fā)現12種蛋白在肺鱗癌患者中表達上調，9種蛋白表達下調，其中1種表達上調的蛋白和1種表達下調的蛋白經驗證，結果與2－DE結果一致。也有學者利用組織噴霧技術對肺癌組織進行研究，Wei等［24］將38例肺鱗癌患者的組織及癌旁組織用LTQ－XL質譜儀對組織中的脂類分別進行質譜分析研究，發(fā)現肺鱗癌患者的組織中5個強度較高的峰，其m/z分別為：154.03、170.06、798.90、808.49、832.43，在癌旁組織中則找到強度較高的峰：m/z 203.08、757.47、782.52；并發(fā)現結合偏最小二乘線性判別分析法分析結果可以快速將癌癥和非癌癥肺組織區(qū)分開，準確率＞94%。

MALDI－TOF－MS激光束的空間分辨率較高，可用來研究特定生化化合物在組織上的分布，基于MALDI的質譜成像允許組織學相關的蛋白質或脂質的表達，已經成為發(fā)現生物標志物的有力工具［25］。基質輔助激光解析電離質譜用于組織成像技術（MALDI－MS imaging，MALDI－MSI） 是一種全新的分子成像技術，它不局限于特異的一種或者幾種分子，可在組織切片中找到多種分子，并提供這些分子在組織中空間分布的精確信息，同時可對這些蛋白質分子進行相對定量［26］。 MALDI－MSI在腫瘤中的應用主要集中在組織蛋白質及多肽的研究，傳統(tǒng)常用的分析組織中蛋白質的方法可以進行腫瘤標志物的定量分析，但不能評估標志物內分子空間分布情況，免疫組織化學方法保存了標本的空間信息，但前期必須知道腫瘤中的目標蛋白以進行正確的抗體染色，且一次只能測定已知的單一蛋白，而質譜方法則具有免標記、高靈敏性、高特異性、同組分同時檢測的優(yōu)點［27］。

2.6 尿液尿液作為人體代謝物排出機體的重要液體，任何影響體內血液成分改變的系統(tǒng)病變均可引起尿液成分的改變。肺癌患者體內癌細胞的代謝物可能會隨尿液排出體外，尿液輔助診斷肺癌的應用價值有待開發(fā)。An等［28］利用組合式高分辨率液相色譜－質譜聯(lián)用技術對肺癌患者的尿液與正常人的尿液分析，鑒定了包括氨基酸、核苷和吲哚代謝物在內的11種潛在生物標志物。隨著分子物質分離方法和現代質譜鑒定技術的快速更新，尿液中蛋白質最低檢出限和靈敏度大大提升，尿液腫瘤標志物的檢測簡便、無創(chuàng)、患者依從性高，使從尿液蛋白質中篩查腫瘤標志物成為研究者關注的新熱點［29］。

2.7 唾液唾液收集的簡單性及無創(chuàng)性等優(yōu)點使其成為生物標志物發(fā)現過程中更具優(yōu)勢的標本，其中除包含口腔疾病的潛在標志物，還包含可能影響唾液腺并引起唾液量和組成變化的全身性疾病的潛在標志物［30］。 Xiao 等［31］收集肺癌患者與健康人的唾液，將10例肺癌患者和10名健康人的唾液經2DE-DIGE/MS后找到16種候選的生物標志物，篩選4種蛋白進行驗證，在26例肺癌患者和26名健康者的唾液中選取3種蛋白（觸珠蛋白、鋅β2-糖蛋白、人鈣微蛋白）確診實驗后發(fā)現3種蛋白聯(lián)合分析的敏感性可達88.5%，特異性可達92.3%。研究者還用肺癌和健康人的細胞株進行驗證，在肺癌細胞株中上述3種蛋白的表達均較健康人高?？梢娡僖涸诜伟┑陌l(fā)生發(fā)展過程中存在某些變化，可以作為研究肺癌分子標志物的標本，一旦唾液中查找腫瘤標志物成為常規(guī)檢測，其簡便性、無創(chuàng)性的優(yōu)點將使之成為篩查腫瘤標志物的首選標本。

綜上所述，肺癌作為我國常見的惡性腫瘤之一，其致死率占首位［32］，早診斷、早治療是降低其病死率的關鍵。近年來，質譜技術發(fā)展迅速且漸趨成熟，各種技術與質譜結合尋找肺癌生物標志物的研究層出不窮。目前，質譜分析在肺癌生物標志物的研究方面應用廣泛，可分析多種類型的標本，如血液、痰液、呼出氣、肺泡灌洗液、肺組織、尿液、唾液等，其研究成果為改善肺癌的診療現狀具有重要意義，質譜應用于肺癌臨床診斷的時代已經來臨。

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