超臨界CO2萃取技術在植物源農藥提取中的應用

姚 眾，董晨晨，張貴云，張麗萍，劉 珍，范巧蘭，呂貝貝

（山西省農業(yè)科學院棉花研究所，山西運城044000）

隨著現(xiàn)代化農業(yè)的發(fā)展，農藥殘留和土壤重金屬超標等問題日益受到國內外的廣泛關注。國內農業(yè)生產以散戶種植為主，由于操作不規(guī)范，且化學農藥使用次數和用量超過限量標準，極易造成環(huán)境污染、3R 問題（Residue，Resistance，Resurgence）等。因此，對環(huán)境友好、對非靶標生物安全、不易產生抗藥性、促進作物生長并提高抗病性的植物源農藥日益受到重視[1]。

植物源農藥是指利用從植物中提取的活性成分或其次生代謝產物加工而成的制劑[2]。中國地大物博，植物資源豐富，研究植物源農藥具有得天獨厚的優(yōu)勢。目前，我國有很多科研機構和企業(yè)在進行植物源農藥相關的研究，篩選出多種具有高效殺蟲、殺菌、除草活性的植物，同時更加注重對植物源物質特殊生物活性的發(fā)現(xiàn)[3]。而且，市面上已有多種植物源活性成分的農藥取得登記并成功應用，如苦參堿、印楝素等。傳統(tǒng)的植物源農藥提取方法（如溶劑提取法、水蒸氣蒸餾法[4]等）提取率不高、工序復雜、周期長。超臨界CO2流體（SCF-CO2）萃取技術作為一種新型的萃取分離技術具有保持生物活性、提取率高、操作簡便、效率高等優(yōu)點，適用于提取植物源農藥，尤其適于穩(wěn)定性差的活性物質。葛發(fā)歡等[5]用超臨界萃取法研究了從黃山藥中萃取薯蕷皂素的最佳條件，與傳統(tǒng)的汽油法相比，不僅提取率提高了1.5倍，而且避免了使用汽油這種危險化學品易燃易爆的危險。郭清泉等[6]利用降香植物的根和莖，采用超臨界萃取法進行提取，并與水蒸餾法對照，超臨界萃取法較水蒸餾法大大提高了樣品的提取率。

1 SCF-CO2萃取技術概述

超臨界流體（Supercritical Fluid，SCF）是一種溫度和壓力均高于其臨界狀態(tài)，介于氣體與液體之間的流體。超臨界流體兼具氣體和液體的雙重特性，其密度與液體相近，黏度和氣體相近，但其擴散系數約比液體大100倍?；谌芙膺^程中發(fā)生的分子間相互作用、擴散作用等因素，使得SCF對許多物質都有很強的溶解能力。超臨界流體萃?。⊿upercritical Fluid Extraction，SFE）就是基于SCF的理化特性，將其作為萃取劑，從液體或固體物質中分離出特定成分的一種新型分離技術[7]。CO2以無毒、無害、易于分離、臨界溫度（31.4℃）接近室溫、臨界壓力也不高（7.38 MPa）等優(yōu)勢，成為應用最廣、最多的一種超臨界流體[8]。超臨界CO2流體萃?。⊿FECO2）利用SCF的強溶解能力特性，可以從植物中提取多種有效成分，再通過減壓、升溫等步驟將萃取物分離出來，從而獲得目標物質。

1.1 SCF-CO2萃取原理

SCF-CO2對溶質的溶解度受其密度影響。當其處于臨界點附近時，壓力和溫度的細微變化使得其密度隨即發(fā)生變化，從而導致溶解度的改變。因此，可通過對溫度或壓力的調節(jié)來改變SCF-CO2的溶解能力[9]，使其溶解度在較大范圍（100～1 000倍）內得到提高，選擇性地萃取不同沸點、極性、相對分子質量的物質。一般情況下，SCF-CO2的溶解能力隨其密度的增大而升高。恒壓狀態(tài)下，溫度升高，溶質的溶解度減??；恒溫狀態(tài)下，壓力升高，溶質的溶解度增大[10]。

1.2 SCF-CO2萃取植物源農藥的優(yōu)越性

SCF-CO2萃取技術在植物源農藥的提取中與傳統(tǒng)方法相比，具有一系列的獨特優(yōu)點：首先，CO2的超臨界溫度較低（31.4℃），方便在接近室溫且有CO2氣體籠罩的環(huán)境下進行萃取，實驗條件溫和，不會破壞溶質中的生物活性物質，在防止熱敏性物質氧化和逸散上效果良好，所以，特別適用于一些低揮發(fā)度和熱敏性物質的分離和精制[11]；其次，CO2簡單易得、經濟適用，無毒、無害，不產生殘留物，萃取過程對人體無害，對環(huán)境無污染，是純天然萃取技術[12]；第三，SCF-CO2萃取選擇性好，通過對壓力和溫度的控制可以改變超臨界CO2的密度，進而影響其對物質的溶解能力，實現(xiàn)針對性地萃取植物中目標物質，萃取過程中，通常無相變的過程，只涉及顯熱，且SCF-CO2在整個循環(huán)過程中溫差小，便于實現(xiàn)熱量回收，節(jié)省能源[13]；第四，萃取和分離可一步完成，萃取產品的純度較高。通過選擇適當的壓力、溫度和夾帶劑，可提取出高純度的目標產品，尤其適用于植物源農藥中活性物質的精制[14]。

2 SFE-CO2在植物源農藥提取中的應用

由于超臨界CO2流體萃取技術具有如上諸多優(yōu)點，近年來其在植物源農藥提取中得到了廣泛的應用。

2.1 萜類化合物的提取

萜類化合物是異戊二烯的整數倍的烴類化合物及其含氧衍生物，是一種天然化合物，廣泛存在于植物體內，特別是針葉樹中。作為植物源農藥的有效成分之一，其具有破壞害蟲信息傳遞和交配、內吸、拒食、麻醉、抑制生長發(fā)育、觸殺和胃毒作用。萜類化合物熱穩(wěn)定性較差，傳統(tǒng)的提取方法不但提取率低，且易引起有效成分的分解、變質和揮發(fā)。SFE-CO2可利用CO2臨界溫度接近室溫的特性，高效萃取出萜類化合物，既省時又省力。印楝素是世界上公認的活性最強的植物源殺蟲劑[15]，美國農業(yè)部稱其為“可解決全球問題之樹”[16]，屬于四降三萜類化合物，在光照、高溫、水分等條件下極易分解失活。徐勇等[17]研究表明，SFE-CO2與傳統(tǒng)的溶劑萃取法相比，設備簡單、成本低、不會破壞印楝素的生物活性組分、無有機溶劑污染，適合工業(yè)化大量連續(xù)生產。趙淑英等[18]從印楝中提取印楝素，以甲醇為夾帶劑，在2.3 MPa，32℃，CO2流量為10 m3/h條件下萃取2 h得到印楝素粗提物，其室內殺甜菜夜蛾的活性比利用微波輔助提取等其他萃取方法得到的高，且提取速度快、效率高、易分離。呂兆林等[19]用SFE-CO2從油松針葉中萃取以α-蒎烯和β-石竹烯為代表的萜烯類化合物，在萃取壓力15 MPa、萃取溫度40℃、萃取時間20 min時，萃取率較高，比水蒸氣蒸餾省時且樣品回收率高。

2.2 黃酮類化合物的提取

黃酮類化合物廣泛存在于自然界，是一類具有2-苯基色原酮結構的化合物，通常能與植物體中的糖結合成苷類，也有一些以游離態(tài)（苷元）形式存在。絕大多數植物都含有黃酮類化合物，該物質在植物的營養(yǎng)生長、生殖生長和抑菌防病等方面有重要作用。通過SFE-CO2萃取植物源農藥中的黃酮類化合物，此方法較傳統(tǒng)方法操作簡單，萃取分離可一步完成，產品純度高。MARIA等[20]通過傳統(tǒng)的壓榨、超臨界流體萃取和微波萃取等不同方法萃取黃連堿，結果表明，超臨界萃取法萃取出的黃連堿含量最高。SFE-CO2萃取苦蕎中黃酮類化合物，當苦蕎顆粒0.3 mm，添加無水乙醇3%為夾帶劑，50℃，30 MPa條件下萃取120 min，萃取率（1.2%左右）達到最大[21]。韓鳳麟[22]用SFE-CO2萃取墨旱蓮中黃酮類化合物的最佳工藝條件為：萃取溫度40℃，萃取時間2 h，夾帶劑80%乙醇，乙醇流量為0.4 mL/min。在提取紅薯葉黃酮中，當萃取溫度50℃，萃取壓力30 MPa，夾帶劑80%乙醇，CO2流量15 L/h時，黃酮得率6.25%[23]。由文穎等[24]提取山楂核黃酮的研究中，每50 g原料加入75%乙醇75 mL，萃取時間為90 min，萃取溫度40℃，萃取壓力25 MPa，黃酮提取率為3.308%。甘蔗葉中黃酮類化合物的最佳提取工藝條件為乙醇體積分數為70%，料液比1∶40（g/mL），浸取時間為3.0h，浸取溫度為70℃，在此條件下甘蔗葉黃酮類化合物提取率可達5.81%[25]。

2.3 精油類化合物的提取

植物精油是植物組織中隨水蒸氣蒸餾而出的成分,包括酚、酸、醛、醇以及芳香族化合物類等[26]，具有植物特征性氣味，常溫下為易揮發(fā)的油狀液體，帶有芳香氣味，幾乎不溶于水，但可溶于多數有機溶劑和高濃度乙醇中。此類物質具有毒殺、拒食、抑制生長發(fā)育和昆蟲性外激素的引誘作用。李兵[27]在提取土荊芥精油時，得出粒度0.25～0.42 mm，萃取參數分別為，壓力20 MPa，溫度55℃，分離壓6 MPa，分離溫度60℃，萃取時長65 min，CO2流量為34～36 L/h，此條件下萃取率為7.92%。SFE-CO2萃取較傳統(tǒng)方法提取率較高，且避免了提取中油脂成分氧化、酸敗和有機溶劑殘留等問題。賈秀艷[28]研究表明，SC-CO2萃取薄荷精油的最佳工藝條件為CO2流量為35 kg/h、萃取溫度40℃，萃取壓力35 MPa、萃取時間2.5 h，此條件下薄荷精油提取率為3.32%。強磊[29]分別利用單因素和響應面試驗設計方法，將超臨界CO2流體萃取野胡蘿卜籽精油的工藝進行了優(yōu)化，確定其最佳工藝條件：萃取壓力13.46 MPa、萃取溫度40.16℃、夾帶劑添加量為3.25%，野胡蘿卜籽精油得率預測值為17.68%。江志利[30]研究表明，樣品量為1 g時，SC-CO2萃取木姜子植物揮發(fā)油的較佳工藝條件為：采用先靜態(tài)后動態(tài)的萃取方式。靜態(tài)萃取壓力27.58 MPa，時間10 min；動態(tài)萃取壓力27.58 MPa，萃取溫度55℃，CO2體積40 mL，揮發(fā)油最佳得率為7.85%。徐敬東[31]采用水蒸氣蒸餾提取和CO2超臨界流體萃取2種方法，進行紫藤種子揮發(fā)油的提取。結果表明，SC-CO2萃取溫度40℃、萃取壓力25 MPa，乙醇含量5%，提取時間2.5 h，此條件下精油提取率為10.50%，水蒸氣蒸餾提取的提取率為0.011%。超臨界提取的提取率遠遠大于水蒸氣蒸餾提取，存在明顯差異。通過GC-MS分析發(fā)現(xiàn)，2種提取方法得到的精油成分具有較大的差異，超臨界提取精油對3種真菌的抑制活性均優(yōu)于水提精油。

2.4 生物堿的提取

生物堿是存在于自然界中的一類含氮的堿性有機化合物，有類似堿的性質，大多有復雜的環(huán)狀結構，是植物源農藥中重要的有效成分之一。生物堿是植物次生代謝產物中較大的一類，目前從植物中分離出來的生物堿有5 000～7 000種[32]。通常生物堿類在植物源農藥中殺蟲毒力最強，一般通過毒殺、拒食、麻醉和抑制生長發(fā)育等方式作用于昆蟲?？鄥A、氧化苦參堿作為廣譜殺蟲劑，用于防治黏蟲、菜青蟲、蚜蟲等，主要來源于苦參、山豆根等。劉修樹等[33]運用正交試驗法探討SC-CO2萃取苦參中苦參堿的最佳工藝：將苦參藥材粉碎后過0.25 mm篩，加0.5 mL/L氨水浸潤過夜，4倍量75%乙醇（V∶V）作為夾帶劑，在 25 MPa，60℃，萃取 3 h，CO2流量40 kg/h時，萃取物中苦參堿含量最高，為22.97～24.23 mg/g。蔡智慧等[34]研究表明，通過正交試驗確定了披針葉黃華總生物堿SC-CO2流體萃取的最佳工藝為：萃取溫度45℃，萃取壓力20 MPa，CO2流量20 kg/h、萃取時間80 min，此條件下總生物堿得率為3.12%。佟若菲等[35]研究發(fā)現(xiàn)，黃連生物堿最佳萃取工藝條件為：萃取溫度60℃，萃取壓力30 MPa，物料粒度 0.25～0.42 mm，萃取時間 1.5 h，此條件下黃連中生物堿萃取率為14.24%。ARVIND等[36]測定，長春花生物堿最適宜萃取條件：25 MPa，40 min，80℃，夾帶劑為甲醇，提取率4.1%。盛桂華等[37]通過4因素3水平的響應曲面試驗設計，研究分步SFE-CO2萃取山豆根中苦參堿的最佳工藝：山豆根干燥粉碎后，按料液比2∶1加入0.1 mol/L氨水浸泡過夜后過濾，濾渣投入萃取釜，每隔1.5 h取樣1次，共取2次，第1步萃取溫度80℃，萃取壓力45 MPa，以100%乙醇（V∶V）為夾帶劑，用量80 mL/100 g；第2步萃取溫度30℃，萃取壓力25 MPa，夾帶劑不變，該條件下萃取苦參堿萃取率達96%。大多生物堿以鹽的形式存在于植物組織中，在SFE-CO2萃取時，提前用堿化劑（如氨水、Na2CO3和Ca（OH）2溶液等）處理原料，使原來與酸結合的生物堿鹽轉變成游離態(tài)，增加其在SFE-CO2中的溶解度，以提高萃取效率。

3 展望

超臨界CO2萃取技術因為其環(huán)保、生產安全、不會損害產品活性、提取效率高等特點受到廣泛關注，已經成為植物源農藥提取中一種非常具有發(fā)展?jié)摿Φ母咝绿崛》蛛x技術。但是在植物源農藥的提取中依然有其自身的局限性，對于許多極性較強的物質尤其是生物堿類物質很難進行有效的萃取分離，需要加入適合的夾帶劑，提高萃取率。何雁等[38]探討SFE-CO2萃取丹參酮的最佳工藝條件，采用均勻設計法對影響萃取結果的因素進行考察，發(fā)現(xiàn)夾帶劑用量影響萃取結果最為顯著，當夾帶劑用量10%時，萃取效率最高。所以，今后應在夾帶劑方面進行重點研究，可以在夾帶劑類型、用量和濃度等不同條件下對比萃取率，得出不同成分的最佳萃取工藝。

超臨界CO2萃取技術因其設備投資大，未能普遍應用，并在萃取時常需要加入夾帶劑，影響溶劑的溶解度和選擇性，因此，需要依據大量的實驗數據選擇合適的夾帶劑和用量[39]。大量的實驗數據依托于試驗設計和優(yōu)化方法。目前，國內研究常用的方法有正交設計、星點設計、均勻設計以及響應面設計法，這些方法在優(yōu)化植物源農藥的提取中得到廣泛應用[40]。不同的試驗設計和優(yōu)化方法各有自身的優(yōu)勢和局限，因此，我們應根據不同需要選擇適宜的萃取方式和優(yōu)化方法，這樣能極大地提高工藝優(yōu)化的效率和準確性。另外，可以將超臨界CO2萃取技術與傳統(tǒng)方法有效結合，優(yōu)勢互補，大大提高萃取效率，對于促進超臨界CO2萃取技術的發(fā)展有重要意義，也將推動植物源農藥的研究向更高層次發(fā)展。