一種快速批量轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉雜交后代的篩選方法

趙俊俠 ，陳 耕 ，潘轉(zhuǎn)霞 ，郭海莉 ，夏 芝 ，孫振綱 ，朱永紅 ，胡曉麗

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運(yùn)城044000；2.稷山縣農(nóng)業(yè)局，山西稷山043200）

轉(zhuǎn)基因抗蟲棉是指棉花細(xì)胞染色體上整合有外源抗蟲基因的棉花品種?？瓜x基因通常為來源于蘇云金芽孢桿菌的Bt基因（Bacillus thuringiensis，蘇云金芽孢桿菌）的簡稱，它是一種革蘭氏陽性菌，在地球上分布十分廣泛。Bt基因?qū)[翅目昆蟲有專一的殺傷作用，能產(chǎn)生多種對昆蟲有特異活性的殺蟲蛋白。棉花抗蟲育種歷史不長，由于外源基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的局限，目前所獲得的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，其遺傳基礎(chǔ)還較為單一，遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代棉花生產(chǎn)發(fā)展對品種的高要求。在棉花品種選育中，通過不同性狀的棉花株系進(jìn)行雜交，以期獲得具有不同親本所攜帶的優(yōu)良性狀，并且一定要兼具抗蟲特性，即后代材料要攜帶Bt基因。在轉(zhuǎn)基因抗蟲棉雜交后代材料中，由于雜交二代出現(xiàn)分離，后代材料含有大量無效或不可利用的雜交后代。所以，在大量的后代材料中，選擇含有外源基因的目標(biāo)植株是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的重要步驟。根據(jù)NptⅡ基因（卡那霉素標(biāo)記基因）與Bt抗蟲基因緊密連鎖的關(guān)系[1]，通過對植株抗卡那霉素特性的篩選，來獲得帶有Bt基因的后代材料。

轉(zhuǎn)基因抗蟲棉雜交后代鑒別的常用方法有PCR擴(kuò)增電泳檢測法和田間卡那霉素涂抹鑒定法[2]。PCR擴(kuò)增電泳是最常用的實驗室轉(zhuǎn)基因植株遺傳檢測方法[3]，但存在諸多缺點，需要實驗室和儀器，DNA制備過程復(fù)雜繁瑣且實驗技術(shù)要求高，鑒別時，花費(fèi)且工作量巨大。田間卡那霉素涂抹鑒定[4]，夏天高溫作業(yè)一株一葉涂抹，工作量大而繁重，受天氣環(huán)境影響大且因操作的人為差異造成鑒定結(jié)果假陽性偏多。因此，把棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)和種子發(fā)芽技術(shù)相結(jié)合，設(shè)計出本試驗的一套技術(shù)方法，不同于實驗室操作、高效快捷、簡便實用的棉花轉(zhuǎn)基因后代植株的檢測與篩選方法，以滿足在棉花育種生產(chǎn)中，大量群體轉(zhuǎn)基因抗蟲棉雜交后代的篩選與鑒定需要。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為以多抗、豐產(chǎn)、高衣分晉棉19為母本，抗蟲品系運(yùn)148為父本雜交組合的F2種子，隨機(jī)選出100粒備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 卡那霉素選擇試驗 種子經(jīng)硫酸脫絨后，用70%酒精浸泡2 s，然后放入10%～15%H2O2消毒2～4 h，用無菌水沖洗，浸泡于三角瓶中，封口，在20～30℃下經(jīng)過24 h，待種子萌動后，去種皮接種或直接放入培養(yǎng)后續(xù)制備的器皿中培養(yǎng)[5]。條件許可的實驗室采取經(jīng)高溫滅菌的培養(yǎng)皿，農(nóng)戶、農(nóng)場或無實驗條件時采用蒸煮過的盤碟等，在其底部鋪2層高溫滅菌或蒸煮過的紗布或毛巾一層。

將150 mg/L的卡那霉素溶液倒入培養(yǎng)皿或盤碟，盤碟加盤碟為蓋，保持水分，光照培養(yǎng)或暗培養(yǎng)均可，培養(yǎng)溫度28℃。器皿大小以需檢測種子多少為根據(jù)準(zhǔn)備。培養(yǎng)時間：去種皮接種培養(yǎng)需要2 d[6]，直接放入培養(yǎng)不去種皮接種需要4 d。2 d后，對種子下胚軸伸長觀察并對長度進(jìn)行測量，生長較快的種子，下胚軸伸長達(dá)2.3 cm以上，飽滿有活力，部分種子則表現(xiàn)為下胚軸略微伸長或僅僅子葉稍微展開，缺乏生機(jī)，下胚軸長度不到2.3 cm。

1.2.2 PCR檢測對比試驗 100粒F2出現(xiàn)分離的雜交后代的種子，用1.2.1所述方法進(jìn)行篩選鑒別后，提取棉花幼苗葉片DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增電泳。

2 結(jié)果與分析

本試驗選取100粒F2出現(xiàn)分離的雜交后代種子，測量種子萌發(fā)后的下胚軸長度，再提取棉花幼苗葉片DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增電泳，進(jìn)行Bt基因檢測。由于有些種子成熟度較差，處理過程中腐爛或沒有成苗，共獲得64例有效幼苗，下胚軸伸長大約2.3 cm以上的有36株，不到2.3 cm的有28株。結(jié)果表明，使用該方法對轉(zhuǎn)基因抗蟲棉雜交后代材料篩選與經(jīng)PCR檢測結(jié)果一致。因為在導(dǎo)入的外源基因構(gòu)建中，NptⅡ基因（卡那霉素標(biāo)記基因）與Bt抗蟲基因緊密連鎖，因此，含有NptⅡ基因（卡那霉素標(biāo)記基因）的檢測材料會在150 mg/L的卡那霉素基質(zhì)上生長伸長，伸長的種子含著Bt抗蟲基因，反之則不含抗蟲基因。

3 結(jié)論與討論

本研究討論的是以Bt抗蟲棉的成熟種質(zhì)材料作為親本產(chǎn)生的雜交后代，在推廣生產(chǎn)中應(yīng)用的品種，Bt基因和NptⅡ基因連鎖，存在于一條染色體上，在育種中表現(xiàn)為穩(wěn)定遺傳。如李汝忠等[7]用抗蟲親本與非抗蟲親本直接雜交的F1，在田間自然感蟲條件下，均表現(xiàn)出高抗棉鈴蟲性，抗性不分離。該方法還可以用于轉(zhuǎn)基因單株[8-9]的檢測。即使出現(xiàn)個別分離現(xiàn)象，在品種育成過程中，會通過抗蟲性檢測試驗排除，因為不管是本研究的試驗方法、卡那霉素涂抹、PCR檢測等，都是一種對抗蟲基因的篩選替代，最終品種的抗蟲特性必須通過抗蟲性檢測。

在培育抗蟲棉花品種過程中，李朋波等[10]研究表明，以常規(guī)棉和轉(zhuǎn)基因抗蟲棉及其雜交、回交后代為材料，對卡那霉素抗性與測蟲鑒定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明，二者鑒定結(jié)果一致性達(dá)96%以上。本研究表明，更好選擇和利用雜交組合后代中種質(zhì)資源，配合育種的計劃周期，結(jié)合播種時間或南繁安排，將批量的雜交后代種子利用該方法篩選萌發(fā)后下胚軸長度2.3 cm以上的種子，可直接開溝播種于試驗區(qū)域或大田。本試驗方法不僅可以更準(zhǔn)確地控制假陽性，而且對后代的鑒別大約能提早4～5個月，不但節(jié)省了檢測成本，縮短了檢測時間，使后續(xù)其他途徑的驗證更加具有針對性。因此，本研究的方法更利于在非實驗室條件下，對育種中大量棉花轉(zhuǎn)基因后代種子進(jìn)行快速篩選與鑒定。