p53基因在食管癌治療中的表達(dá)及作用

張加勇　胡欣　文世民

(川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)院·南充市中心醫(yī)院腫瘤中心，四川 南充　637000)

食管癌是臨床常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，腫瘤發(fā)病率位于全球第8位，死亡率位于第6位。我國(guó)食管癌發(fā)病率和死亡率均居世界首位，每年約21萬(wàn)人死于食管癌，占全球食管癌死亡患者一半以上[1]。食管癌高死亡率的主要原因是缺乏有效的診斷及治療方法。食管癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)其具有多階段、多因素、進(jìn)行性演進(jìn)的特點(diǎn)，基本過(guò)程包括正常粘膜→基底細(xì)胞過(guò)度增生→不典型增生→原位癌→浸潤(rùn)癌[2]。在這過(guò)程中，有多種調(diào)整因子共同參與細(xì)胞的癌變。癌基因的激活和抑癌基因的失活是細(xì)胞癌變的分子基礎(chǔ)。近年來(lái)，隨著對(duì)分子生物學(xué)研究的發(fā)展，對(duì)于疾病的病因、發(fā)生、發(fā)展的研究已深入到了分子水平?；蛑委熞阎饾u從理論成為現(xiàn)實(shí)，具有：選擇性強(qiáng)、副作用小、對(duì)晚期腫瘤及轉(zhuǎn)移灶的治療仍有效等優(yōu)點(diǎn)，各類(lèi)研究實(shí)驗(yàn)表明p53基因?qū)κ彻馨┑闹委熡兄匾R床意義[3,4]。目前手術(shù)、放療、化療都是食管癌治療的重要手段，而對(duì)于不能手術(shù)或不愿手術(shù)治療的患者放化療是該病治療的主要手段，但中晚期食管癌的治療效果仍不甚滿(mǎn)意，因此利用p53基因治療食管癌在臨床應(yīng)運(yùn)而生，且已取得一定效果。本文將近年來(lái)p53基因與食管癌治療的研究進(jìn)展做一簡(jiǎn)要綜述。

1　p53基因的結(jié)構(gòu)及表達(dá)

p53基因位于染色體17q13.1，含11個(gè)外顯子，其轉(zhuǎn)錄翻譯編碼的野生型P53(WtP53)蛋白由393個(gè)氨基酸殘基組成，有多個(gè)功能域。主要由定位于氨基酸1-50位間的N-末端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域AD1、AD2與通用轉(zhuǎn)錄因子TFIID結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活功能，p53與TFIID中的TAF結(jié)合，作用于下游基因啟動(dòng)子中的TATA box，起到轉(zhuǎn)錄激活功能；定位于氨基酸65-90位間的生長(zhǎng)抑制結(jié)構(gòu)域，富含脯氨酸，有5重復(fù)的PXXP序列，可與含SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相互作用，將p53與信息傳遞途徑連接起來(lái)。另外還有：定位于氨基酸100-300位間序列特異的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；定位于氨基酸殘基316-325位間的核定位信號(hào)NLS；定位于氨基酸殘基334-356位間的四聚體寡聚化結(jié)構(gòu)域；C-末端非專(zhuān)一DNA調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，可提供DNA損傷信號(hào)并參與核心區(qū)與DNA 結(jié)合的別構(gòu)調(diào)節(jié)。P53蛋白含有DNA結(jié)合位點(diǎn)及多個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，其中F19、W23和L26為P53與MDM2蛋白相互作用所必需，其中F19、L22和W23參與P53與TAF 的相互作用[5]。

2　p53基因功能

p53的細(xì)胞內(nèi)活性作用是介導(dǎo)DNA 損傷后的細(xì)胞應(yīng)急反應(yīng)，避免受損DNA 的堆積，維持遺傳的穩(wěn)定性，這主要體現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞周期的阻滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和DNA 修復(fù)。此外，p53 還參與細(xì)胞分化、衰老的調(diào)節(jié)，以及抑制血管生成， 這些功能的完成均依賴(lài)于p53 與DNA 相互作用。作為轉(zhuǎn)錄因子，p53 可以調(diào)控下游多種基因的表達(dá)。

2.1　對(duì)細(xì)胞周期阻滯作用

在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中，p53主要監(jiān)測(cè)與轉(zhuǎn)錄激活作用密切相關(guān)的G1和G2/M期校正點(diǎn)[6]。p53下游基因P21(WAF/CIP1)編碼蛋白是一個(gè)依賴(lài)Cyclin的蛋白激酶抑制劑，一方面P21WAF1與一系列Cyclin-cdk 復(fù)合物結(jié)合抑制相應(yīng)的蛋白激酶活性，導(dǎo)致高磷酸化Rb蛋白堆積，后者使E2F轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子不能活化，導(dǎo)致G1期阻滯；另外P21WAF1可與PCNA結(jié)合，阻斷DNA復(fù)制。p53的另外3個(gè)下游基因Cyclin B1、GADD45和I4-3-3則參與G2/M期阻滯。p53下調(diào)Cyclin B1表達(dá)，細(xì)胞則不能進(jìn)入M期，GADD45通過(guò)抑制Cyclin B1-cdc2復(fù)合物的活性發(fā)揮作用，I4-3-3與cdc25c結(jié)合干擾Cyclin BI-cdc2復(fù)合物發(fā)揮錄調(diào)節(jié)作用[7]。

2.2　促進(jìn)細(xì)胞凋亡

p53可以上調(diào)bax的表達(dá)水平，以及下調(diào)bcl-2的表達(dá)共同完成促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用，bax 可與線(xiàn)粒體上的電壓依賴(lài)性離子通道相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞色素C 的釋放，具有凋亡作用，bcl-2可阻止凋亡形成因子如細(xì)胞色素C 等從線(xiàn)粒體釋放出來(lái)，具有抗凋亡作用。定位于線(xiàn)粒體的NOXA和P53AIPI等基因可直接被p53激活，其過(guò)表達(dá)能促進(jìn)凋亡。p53還可通過(guò)TNF受體和Fas蛋白等死亡信號(hào)受體蛋白途徑誘導(dǎo)凋亡。也有學(xué)者認(rèn)為p53還可直接刺激線(xiàn)粒體釋放高毒性的氧自由基來(lái)引發(fā)凋亡[8]。

2.3　維持基因組穩(wěn)定性

DNA受損后因錯(cuò)配修復(fù)的累積導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，遺傳信息發(fā)生改變。p53基因的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域本身具有核酸內(nèi)切酶活性，可切除錯(cuò)配的核苷酸，結(jié)合并調(diào)節(jié)核苷酸內(nèi)切修復(fù)因子X(jué)PB和XPD的活性，參與DNA重組和修復(fù)。p53還通過(guò)與p21WAF1、GADD45 和PCNA形成復(fù)合物，利用自身的3'～5'核酸外切酶活性，參與DNA修復(fù)。p53參與DNA 修復(fù)過(guò)程的另一證據(jù)是在DNA損傷后p53能特異性誘導(dǎo)核糖核苷酸還原酶基因的表達(dá)，而后者在大多數(shù)生物體內(nèi)調(diào)控DNA 錯(cuò)配后維持基因組的穩(wěn)定性中發(fā)揮重要功能[9]。

2.4　抑制腫瘤血管生成

有研究認(rèn)為在食管癌中p53基因和VEGF之間有正相關(guān)性。p53基因通過(guò)調(diào)控腫瘤組織中VEGF的表達(dá)引起腫瘤血管生成，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移。在P53+/VEGF+的腫瘤中，其微血管密度(Microvessel density，MVD)明顯增高，且易發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；而P53-/VEGF-的標(biāo)本中MVD則較低，則多見(jiàn)于非轉(zhuǎn)移組中。這些結(jié)果表明p53可能通過(guò)VEGF調(diào)節(jié)腫瘤血管生成的途徑[10]。

3　p53基因與食管癌

p53基因是目前已發(fā)現(xiàn)的與人類(lèi)食管癌相關(guān)性較高的抑癌基因。在所有的惡性腫瘤疾病中，人類(lèi)腫瘤組織中有50%以上的p53基因會(huì)發(fā)生突變，在食管癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中p53突變和高表達(dá)起重要作用，中國(guó)醫(yī)科院腫瘤醫(yī)院赫捷院士等對(duì)113對(duì)食管鱗癌和正常樣本以及8種細(xì)胞系進(jìn)行外顯子組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在99%的病例中p53蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高達(dá)93%[11]。

p53基因與食管癌放化療聯(lián)合應(yīng)用，主要是使用重組人p53 腺病毒(rAd2p53)為載體導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮野生型p53基因的功能，p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是Ad-p53直接的抗腫瘤機(jī)制。Ad-p53屬于C組5型腺病毒，主要依靠靶細(xì)胞表面的柯薩奇病毒和腺病毒受體(Coxsackie and adenovirus receptor，CAR)與細(xì)胞結(jié)合。而CAR在人類(lèi)腫瘤中的表達(dá)水平通常比較低，因此阻礙了腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移和抗腫瘤作用，吳雅瓊等[11]通過(guò)研究認(rèn)為Ad2p53對(duì)食管癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性與腺病毒受體的表達(dá)基因正相關(guān)性。Lu Ping等[13]將45例診斷為食管鱗癌的不能手術(shù)或不愿手術(shù)的患者隨機(jī)分為兩組(rAd2p53+RT(治療組n=22)和RT(對(duì)照組n=23))，結(jié)果顯示治療組的OR(等于CR+PR)及CR均高于對(duì)照組，其CR高于對(duì)照組3倍。王少龍等[14]采用隨機(jī)單盲法將60例非手術(shù)食管癌患者分成單純組(采用劑量60-70Gy的常規(guī)分割三野等中心照射)和綜合治療組(單純放療組+tAd-p53瘤體內(nèi)局部注射每周一次，連續(xù)6周；同時(shí)配合每周兩次共12次的腫瘤深部熱療)結(jié)果的兩組的總有效率OR比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且綜合治療組的嚴(yán)重放療毒性反應(yīng)的發(fā)生率顯著降低。崔紅利等[15]利用P53腺病毒注射液聯(lián)合替吉奧治療中晚期食管癌，分別在治療4、8、12周觀察療效，其聯(lián)合治療組(p53腺病毒注射液聯(lián)合替吉奧50 mg，口服，2次/d，d1-14×4)的有效率OR均約比單獨(dú)化療組(替吉奧50 mg，口服，2次/d，d1-14×4)高1倍。上述實(shí)驗(yàn)均認(rèn)為p53基因可增加食管癌對(duì)放化療敏感性，提高療效，無(wú)明顯副作用，是一種有前景的治療方式，但Tomoki Makino等[16]通過(guò)對(duì)64位食管癌局部進(jìn)展(T2-T4)病人行放化療(40-60 Gy，低劑量5氟尿嘧啶+順鉑)前檢測(cè)患者p53突變基因和P53免疫組化結(jié)果顯示，無(wú)論P(yáng)53免疫組化陽(yáng)性與否，若患者p53基因突變陽(yáng)性，則療效極差，故研究者認(rèn)為放化療前對(duì)患者行p53基因突變與否的分析可了解患者的預(yù)后情況。

4　p53與其他基因?qū)κ彻馨┑墓餐饔?/h2>

有關(guān)抗腫瘤基因的研究已從單基因研究進(jìn)展到了兩個(gè)甚至多個(gè)基因的研究，miR-34a基因是新近發(fā)現(xiàn)并備受關(guān)注的miRNA之一，MicroRNA(miRNA)是一種進(jìn)化中高度保守的不編碼蛋白質(zhì)的小RNA，主要參與細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、發(fā)育等許多復(fù)雜生命過(guò)程的調(diào)控[17]。在發(fā)現(xiàn)miR-34a之前，人們普遍認(rèn)為參與p53調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的因子均為蛋白質(zhì)產(chǎn)物。但是當(dāng)研究人員在激活p53后對(duì)細(xì)胞中miRNA轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)p53能夠顯著地誘導(dǎo)mir-34a的轉(zhuǎn)錄。這提示了p53基因可能直接地參與了非蛋白編碼基因mir-34a的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[18]。mir-34a主要在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞中mir-34a表達(dá)量的減少能夠提高靶基因的表達(dá)水平，從而使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)異常的增值。mir-34a與p53之間有著錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，首先p53通過(guò)調(diào)控許多miRNAs的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和衰老、抑制腫瘤發(fā)生[19, 20]。其次一些miRNAs又通過(guò)直接或間接調(diào)節(jié)p53基因或其上下游基因，參與TP53信號(hào)通路的調(diào)控，發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[21]，F(xiàn)rancisco[22]及龔朝建[23]等認(rèn)為mir-34a不僅是增強(qiáng)p53表達(dá)那么簡(jiǎn)單，而是將p53基因的遺傳毒性維持在一個(gè)穩(wěn)健的系統(tǒng)水平，Zhimin等[24]報(bào)道，在野生型p53基因背景下，mir-34a的抗腫瘤效應(yīng)主要是誘導(dǎo)增強(qiáng)p53蛋白及抑制sirt1基因的表達(dá)，而Hui等[25]認(rèn)為在診斷明確的食管癌標(biāo)本中mir-43a與p53基因沒(méi)有關(guān)聯(lián)性，其可能的原因首先是食管癌中p53基因常常發(fā)生突變，還有就是mir-43a基因甲基化。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNAs)是一類(lèi)長(zhǎng)度大于200 nt且不表現(xiàn)出任何蛋白質(zhì)編碼潛能的RNAs，對(duì)全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，在lncRNAs中特定的超保守元件與正常細(xì)胞的原癌基因有關(guān)，和p53基因等一樣具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。這類(lèi)超保守元件異常表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，引起腫瘤發(fā)生這類(lèi)lncRNAs有H19、hotair、lncRNAs-LET等[26]，而最近對(duì)肝癌、膀胱癌研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs-LET基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)[27, 28]，同時(shí)有研究認(rèn)為lncRNAs可能通過(guò)調(diào)節(jié)p53信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)[29]。Wang等[30]通過(guò)與正常組織對(duì)比發(fā)現(xiàn)在食管癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNAs-LET表達(dá)降低，該結(jié)果表明LET可能與食管癌的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。他們認(rèn)為L(zhǎng)ET可能也利用該通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡，利用Eca109和TE-1細(xì)胞株對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了LET的腫瘤細(xì)胞其p53基因表達(dá)顯著增加，所以LET被認(rèn)為可能激活p53基因的表達(dá)從而誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡。

5　結(jié)語(yǔ)

在我國(guó)以鱗狀細(xì)胞癌為主的食管癌具有自身的流行病學(xué)特點(diǎn)，同時(shí)在危險(xiǎn)因素、基因譜、發(fā)病機(jī)制等方面有別于腺癌，但患者預(yù)后仍較差，目前仍缺乏最佳的治療方案，新輔助放化療+手術(shù)的綜合治療是當(dāng)前局部晚期食管鱗癌比較公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)治療， p53基因是目前發(fā)現(xiàn)與食管癌相關(guān)性較高的抑癌基因。多年來(lái)對(duì)p53基因的結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及相關(guān)功能已經(jīng)有很深入的研究，同時(shí)與lncRNAs、mir-34a等基因的關(guān)系也有一定認(rèn)識(shí)，在當(dāng)前精準(zhǔn)醫(yī)療的大力倡導(dǎo)下，若要基因治療在臨床廣泛得到應(yīng)用，讓患者得到個(gè)體化治療，無(wú)論是基礎(chǔ)研究的還是臨床問(wèn)題的解決都需要投入大量的財(cái)力及精力。

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