2014-2016年四川省瘧疾診斷參比實驗室結(jié)果比較*

鄒晏　李黎　郁濤　吳小紅　劉陽

(四川省疾病預防控制中心，四川 成都　610041)

瘧疾是全球廣泛關注并嚴重危害人類健康的重要蟲媒傳染病。寄生于人體的瘧原蟲包括：間日瘧原蟲、惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲。根據(jù)世衛(wèi)組織2016年12月公布的最新估算數(shù)據(jù)，2015年至少有2.12億瘧疾病例，42.9萬人死亡，多數(shù)病例和死亡發(fā)生在撒哈拉以南的非洲。然而，東南亞、拉丁美洲以及中東地區(qū)也相應受到影響。2015年，91個國家和地區(qū)有持續(xù)性的瘧疾傳播[1]。瘧疾曾是四川省的主要公共衛(wèi)生問題，解放初期發(fā)病率達87.4/萬。新中國成立后隨著防治工作進程，流行強度逐漸減弱，流行面逐漸縮小，1994年以來瘧疾發(fā)病率均在1/萬以下，2001年后穩(wěn)定在1/10萬以下，2011年后我省已沒有本地病例報告[2-6]。

隨著四川省對外交流的逐年擴大，特別是近年來赴非洲、東南亞等瘧疾高流行區(qū)務工人員較多，導致輸入性瘧疾疫情形勢嚴峻， 2014年、2015年四川省輸入性瘧疾病例數(shù)位居全國第3位，2015年四川省惡性瘧死亡病例數(shù)居全國第2位。這些歸國勞務人員輸入的瘧疾，給全省瘧疾防控工作帶來嚴峻的考驗。同時，疫情流行也出現(xiàn)了新的特征。以前本地疫情主要以間日瘧為主，而目前的輸入病例，惡性瘧占很大比例。

2013年4月，四川省啟動全省消除瘧疾考核評估工作。因此提高瘧原蟲的實驗室診斷水平是消除瘧疾達標工作的重點之一，特別是縣級瘧疾診斷實驗室對瘧疾的準確診斷成為達標工作的關鍵。為提高四川省縣級網(wǎng)絡瘧疾診斷實驗室的診斷能力，本文通過省級瘧疾參比實驗室瘧疾診斷結(jié)果的對照，評價縣級實驗室瘧疾診斷能力，分析所存在的問題。

1　臨床資料及方法

1.1　資料來源

收集2014年1月至2016年12月瘧疾防治工作年報表和中國疾病預防控制信息系統(tǒng)(網(wǎng)絡直報系統(tǒng))數(shù)據(jù)，共獲得四川省范圍內(nèi)980例瘧疾患者資料，其中同時有血片和血樣的共計有883例，另有35例同時缺乏血片和血樣，31例有血樣無血片，31例有血片無血樣，不納入本次研究。

1.2　樣本來源

樣本選取2014年1月至2016年12月四川省各縣級疫情報送單位送檢的253份疑似、230份臨床、500份確診瘧疾病例的血片及血樣。所有采集的樣本均保證在采集后1周內(nèi)送省級瘧疾參比實驗室進行復核，省級實驗室在確認樣品信息準確、樣本質(zhì)量合格后，簽收保存。所有樣本均按要求妥善運輸、保存(血片、血樣分別于室溫和—20℃保存)，以保證樣本的可靠性。

1.3　省級瘧疾參比實驗室鏡檢法

采用顯微鏡檢查復核四川省各縣級疫情報送單位中疑似、臨床、確診為瘧疾病例的血片。

1.4　省級瘧疾實驗室PCR檢測法

血樣采用巢氏PCR檢測瘧原蟲。采用國家參比實驗室推薦的，根據(jù)瘧原SSU rRNA基因保守區(qū)設計的擴增瘧原蟲PCR引物(見表1)[7]。核酸提取試劑盒購自Qiagen公司的QIAamp DNA Mini kit(批號：No.51304)，PCR反應混合物購自美國普洛麥格公司，100bp DNAmarker購自上海賽百盛基因技術有限公司，檢測儀器主要有PCR擴增儀(AB2720)、電泳儀(Bio-Rad)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)。

1.5　統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21軟件進行處理，計算相應構(gòu)成比和率。

表1　巢氏PCR檢測瘧原蟲種類的引物及其擴增產(chǎn)物長度

2　結(jié)果

2.1　樣本總體構(gòu)成情況

本次研究分析共納入樣本完整的瘧疾病例883份，其中以惡性瘧原蟲陽性與間日瘧原蟲陽性所占比例最高，卵形瘧原蟲感染病例、三日瘧原蟲感染病例與混合感染病例相對較少，見表2。

2.2　省級鏡檢與PCR復核結(jié)果對比

省級PCR檢測與鏡檢復核結(jié)果完全一致的樣本共計有766例，符合率達到86.75%(766/883)，其中陽性樣本701例，包括間日瘧原蟲陽性284例，惡性瘧原蟲396例，三日瘧原蟲6例，卵形瘧原蟲7例，混合感染8例，見表3。

表2　瘧疾復核樣本結(jié)果構(gòu)成比

表3　瘧疾復核樣本分型陽性符合率

2.3　縣級鏡檢結(jié)果與省級復核結(jié)果比對

以省級PCR和鏡檢檢測的一致結(jié)果為依據(jù)進行統(tǒng)計即共計766例，縣級鏡檢中有701例樣本與省級定性相符，定性陽性符合率為91.51%(701/766)，另有65名非瘧疾患者被誤診。縣級鏡檢分型與省級結(jié)果一致的共有606例，分別為260例間日瘧原蟲，340例惡性瘧原蟲，4例三日瘧原蟲，1例卵形瘧原蟲，1例混合感染，分型陽性符合率為79.11%，其中間日瘧86.96%，惡性瘧84.58%，卵形瘧20.00%，三日瘧80.00%，混合感染為50.00%。另有160例患者感染蟲種鑒別錯誤。有53名患者縣級鏡檢僅判定為瘧原蟲感染陽性，但不能確認其具體分型，經(jīng)省級復核，確認其構(gòu)成分別為間日瘧11例，惡性瘧36例，卵形瘧2例，陰性4例(見表3)。

3　討論

瘧疾為瘧原蟲引起的經(jīng)按蚊傳播的一種寄生蟲病，是世界上最常見和危害最嚴重的熱帶病之一。四川省輸入性瘧疾病例多，分布面廣，全年均可發(fā)生，我省連續(xù)三年輸入性病例數(shù)占全國前三位，提示全省各地均要密切關注輸入性瘧疾疫情，建立監(jiān)測預警機制[8]。

許國君等報道，四川省2010年～ 2013年5月應收集瘧疾血片623張，但只收集和復核了224張，收集率為35.96%。2010年、2011年、2012年和2013年1～5月的收集率分別為：16.1%、44.38%、27.52%和55.05%[2]。而2014年～2016年的瘧疾血片的收集復核率為99.07%。2013年開始制定四川省瘧疾參比實驗室檢測細則，并規(guī)范全省樣本收集細則，近幾年各地區(qū)對瘧疾的重視程度有了明顯加強，為瘧疾預防工作奠定了扎實的基礎，為今后瘧疾的防治提供了寶貴資料。

根據(jù)2014年1月至2016年12月所選取的樣本，縣級與省級復核檢測結(jié)果以及分型陽性符合率發(fā)現(xiàn)縣級實驗室存在誤診(65名誤診病例)、蟲種判定不準確(160名蟲種判定錯誤病例)和不能判定蟲種(53名未分型病例)等問題，與國內(nèi)報道類似[9]。其原因可能有：1、縣級實驗室檢測隊伍不穩(wěn)定，人員流動性大，能力參差不齊，導致實驗室工作質(zhì)量不穩(wěn)定；2、縣級實驗室技術管理不規(guī)范，血片制作質(zhì)量差，給鏡檢造成干擾；3、部分地區(qū)多年無瘧疾病例或輸入性病例逐年減少，導致實驗室診斷技術的缺失和降低；4、感染原蟲種類的復雜化，混合感染的出現(xiàn)，導致縣級實驗室診斷的困難，如表2所示卵形瘧及混合感染的陽性符合率分別為20.00%、50.00%；5、輸入性病例的不規(guī)范用藥，導致現(xiàn)在低密度原蟲數(shù)量增多，增加鏡檢的難度。

在結(jié)果分析中發(fā)現(xiàn)縣級鏡檢有53例未分型(不能定蟲種或無法定蟲種)，這未分型的病例中就有36例為惡性瘧原蟲，惡性瘧原蟲所導致的惡性瘧是臨床癥狀最為嚴重，感染率及致死率在各種瘧原蟲中均占首位，由此帶來的疫情風險也較高。這種未分型存在的問題其結(jié)果直接影響病例治療方案的確定，臨床病例的救治。

臨床上，顯微鏡鏡檢是作為確診瘧原蟲的金標準。但是，由于越來越多的干擾因素存在，如混合感染的增加，低密度原蟲病例的增多，傳統(tǒng)的顯微鏡鏡檢對瘧疾診斷，存在一定的假陰性，無法滿足瘧疾防治工作的要求。新的診斷技術如分子生物學方法、快速檢測試劑條法等應運而生[10]，以巢式PCR為代表的分子生物學方法開始逐漸被應用于瘧疾的實驗室檢測中[11-15]。本組病例的巢氏PCR法與顯微鏡鏡檢的符合率為86.75%，不符合樣本主要集中在混合感染以及低密度原蟲樣本的判定，造成這種差異度的原因除了檢出限的差異，還與病例樣本的保存不當、樣本血樣采集時間的不規(guī)范、病人是否已服用藥物也有一定關系。

縣級實驗室的診斷能力是四川省全省所有縣(市、區(qū))實現(xiàn)消除瘧疾目標，順利通過國家考核驗收的重要技術保證。提高縣級實驗室的診斷能力，需要從制度、培訓和質(zhì)量控制等多方面采取措施。盡管已制定《四川省瘧疾診斷實驗室規(guī)范》來規(guī)范縣級實驗室管理，明確了檢驗技術標準，但仍需完善省、市、縣級瘧疾網(wǎng)絡診斷實驗室的建設，逐級復核的瘧疾網(wǎng)絡診斷機制，為質(zhì)量控制提供保障；需進一步開展針對性強化培訓，以賽代訓等多種形式，提升檢驗人員鏡檢水平；嚴格落實工作制度，加大督導檢查力度，加強質(zhì)量控制管理。

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