誘導(dǎo)型與轉(zhuǎn)基因型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型的研究進(jìn)展

范凱健，吳 菁，李允武，王婷玉*

0 引言

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性自身免疫系統(tǒng)疾病，其特征是嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎癥和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的逐步破壞。RA的病程時間長，致殘率高，如不及時治療，可能會導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能障礙，甚至?xí)奂捌渌鞴侔l(fā)生病變，最終嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前仍未發(fā)現(xiàn)能夠安全、有效地靶向治療RA的藥物。為了研究疾病的發(fā)病機(jī)制，建立出較好的RA動物模型是非常關(guān)鍵的。在最近幾十年的研究中，已經(jīng)開發(fā)出了很多關(guān)節(jié)炎動物模型，并且這些模型在疾病發(fā)病機(jī)制的闡明和新藥研發(fā)的發(fā)展中一直是非常重要的工具。本文將對廣泛使用的關(guān)節(jié)炎模型做一綜述。

1 誘導(dǎo)型

1.1 遲發(fā)性過敏性關(guān)節(jié)炎(Delayed-type hypersensitivity arthritis，DTHA) DTHA為最近發(fā)展的關(guān)節(jié)炎模型，其在C57BL/6小鼠中發(fā)病率為100%，與其他小鼠模型相比，具有發(fā)病率高和差異性小等優(yōu)點(diǎn)。

在2007年，Tanaka等[1]在BALB/c小鼠身上建立了一種新的關(guān)節(jié)炎模型-DTHA。通過用甲基化牛血清白蛋白(Methylated bovine serum albumin，mBSA)聯(lián)合注射低劑量的抗Ⅱ型膠原(TypeⅡcollagen，CⅡ)，隨后再在足爪局部用mBSA加強(qiáng)。結(jié)果顯示，小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的足爪腫脹，滑膜增生，軟骨破壞和骨侵蝕。

2012年，Atkinson等[2]在C57BL/6小鼠身上復(fù)制了DTHA模型。第0天，將mBSA與完全弗氏佐劑(Complete freund′s adjuvant，CFA)的混合物在尾部皮下注射。第4天，靜脈內(nèi)注射CⅡ抗體。第7天，在右腳底部皮下注射20 μl含有200 μl mBSA的PBS，左腳底部則給予20 μl的PBS作為對照。3～7 d后，mBSA刺激的足爪迅速發(fā)展為急性炎癥和嚴(yán)重性關(guān)節(jié)炎。大約2周后炎癥癥狀開始消退。

Atkison等[2]通過流式細(xì)胞術(shù)等分析方法證實(shí)，CD4+T細(xì)胞消耗會阻止DTHA發(fā)展，并且B細(xì)胞不是DTHA誘導(dǎo)所必需的。在該實(shí)驗(yàn)中，疾病發(fā)作是同時進(jìn)行的，所以治療計(jì)劃的開始可以在治療組內(nèi)和治療組之間進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。另外，所有動物發(fā)病和治療的時間相同。這些與其他關(guān)節(jié)炎模型相比，都是一種改善。DTHA的疾病是自限性的，而RA是慢性進(jìn)展性的。因此，長期性的缺失是對模型的限制。Atkinson等[3]研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells，Treg)的耗竭會導(dǎo)致DTHA的惡化，但可被IL-17所抵消。此外，其他研究人員也在進(jìn)行一些研究，以確定該模型能否誘導(dǎo)為慢性病。

雖然DTHA模型還有待改善，但其可能有助于篩選潛在的基于RA的靶向藥物，因?yàn)樵贏tkinson的實(shí)驗(yàn)中，批準(zhǔn)用于RA的靶向藥物在該模型中十分有效。

1.2 膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced arthritis，CIA) CIA是在1980年首次由CⅡ誘導(dǎo)的小鼠模型，并且成為關(guān)節(jié)炎中使用最廣泛的小鼠模型之一。通過在CFA中乳化的CⅡ進(jìn)行免疫接種，在遺傳易感性的小鼠品系中引發(fā)CIA。其隨后的發(fā)病機(jī)制與RA具有相似的嚴(yán)重骨侵蝕和滑膜炎癥的特征。這個模型與RA之間最顯著的差異是類風(fēng)濕因子不存在于CIA中。

CIA經(jīng)典模型是DBA/1 (H-2q)小鼠品系。除了DBA/1小鼠，其他品系也已經(jīng)用于CIA實(shí)驗(yàn)，如B10.Q和C57BL/6。CIA的CⅡ特異性耐受依賴于已經(jīng)鑒定的與主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ型(Major histocompatibility complex typeⅡ，MHCⅡ)Aq分子結(jié)合的CⅡ-肽(氨基酸259～270)[4]。這與RA相關(guān)的DR1和DR4分子選擇幾乎相同。然而，大多數(shù)基因修飾的動物僅在表達(dá)Ab分子的C57BL/6(B6)背景上可用。但研究者對MHC同源菌株的早期分析顯示，表達(dá)Aq的菌株會賦予關(guān)節(jié)炎易感性[5]。因此，在C57BL/6小鼠建立一個可靠的CIA模型是非常重要的。

在DBA/1小鼠CIA中，將CFA和牛CⅡ乳化后，在尾根部進(jìn)行免疫，并在21 d后加強(qiáng)1次。這些小鼠通常會在初次注射后26～35 d發(fā)病。C57BL/6小鼠對牛CⅡ誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎具有抵抗性，而用雞膠原蛋白免疫時可以產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎。

每個品系的小鼠對熱滅活結(jié)核分枝桿菌H37RA(MT)在CFA中濃度的要求是不同的。在DBA/1小鼠中，1 mg/ml的MT就可以發(fā)展為關(guān)節(jié)炎，而在C57BL/6小鼠中，則需要3～4 mg/ml的MT可以發(fā)展為關(guān)節(jié)炎。

Backlund等[5]研究B6模型中關(guān)節(jié)炎的發(fā)生機(jī)制時，發(fā)現(xiàn)CⅡ特異性B細(xì)胞對關(guān)節(jié)炎是非常重要的，但對CⅡ真正的T細(xì)胞反應(yīng)還未明確。研究發(fā)現(xiàn)，在表達(dá)Aq分子的B6小鼠上可以實(shí)現(xiàn)CⅡ免疫反應(yīng)性和慢性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。

Aq分子的雜合子表達(dá)足以誘發(fā)關(guān)節(jié)炎，甚至可能加劇疾病，并且有助于研究對CⅡ真正的T細(xì)胞反應(yīng)[6]。因此，研究人員打算在C57BL/6背景下建立B6N.Q品系小鼠作為未來的標(biāo)準(zhǔn)模型，以便在C57BL/6N背景上表達(dá)Aq分子。

1.3 膠原抗體誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(Collagen antibody-induced arthritis，CAIA ) 1995年，Terato等發(fā)現(xiàn)LPS等細(xì)菌毒素與CⅡ的自身抗體具有很強(qiáng)的協(xié)同作用，可以降低誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎所需的單克隆抗體的閾值水平。這種使用單克隆抗體和LPS混合物的CAIA模型現(xiàn)已被廣泛用于研究自身免疫性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制和評估治療。該模型可以在幾天內(nèi)誘導(dǎo)持續(xù)嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎，而在其他模型中，如CIA，需4周左右的時間。

CAIA的易感性與MHC不相關(guān)，并且可以在B6小鼠中誘導(dǎo)，但其發(fā)病率和嚴(yán)重程度均較低[7]。原來主要是由4種單克隆抗體組成的混合物來誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎，但其關(guān)節(jié)炎有局限性，并且需要較大的劑量來誘導(dǎo)低反應(yīng)小鼠的CAIA。在B6小鼠中需要高達(dá)10 mg/ml小鼠的抗CⅡ來誘導(dǎo)CAIA[8]。

4種單克隆抗體混合物主要是由3個lgG2a (A2-10、F10-21、D8-6)和lgG2b(D1-2G)組成[9]。D1-2G和A2-10識別LyC1(CⅡ124-290)，F(xiàn)10-21和D8-6識別LyC2(CⅡ291-374)。4種單克隆抗體混合物通過識別位于CⅡ的CB11片段(CⅡ124-402)來誘導(dǎo)CAIA的產(chǎn)生。一般來說，因?yàn)榭贵w關(guān)節(jié)炎劑量的閾值下降，使用4種單克隆抗體混合物誘導(dǎo)嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎仍需要LPS(每只小鼠25～50 μg)。Hutamekalin等[10]發(fā)現(xiàn)，通過加入識別CⅡ的LyC1片段的單克隆抗體(CⅡ-3)，可顯著增加4種單克隆抗體混合物對關(guān)節(jié)的致炎性。5種單克隆抗體混合物的致關(guān)節(jié)炎性比原來的4種單克隆抗體高2倍以上，并且在注射LPS之前就能經(jīng)常觀察到中度關(guān)節(jié)炎。結(jié)果表明，LPS劑量降低，既能引發(fā)關(guān)節(jié)炎，又能降低LPS的毒性作用。

總之，新的單克隆抗體混合物誘導(dǎo)的CAIA模型可能成為非常有用的工具。CAIA模型具有疾病發(fā)展快、發(fā)病率高、容易在轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠身上復(fù)制的優(yōu)勢。

1.4 抗原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(Antigen-induced arthritis，AIA) AIA最初是通過在兔關(guān)節(jié)內(nèi)注射抗原誘導(dǎo)的，并且可能是與人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎最接近的模型。在1977年，Brackertz等[11]通過在小鼠身上建立這種模型來研究誘導(dǎo)和持續(xù)性疾病中的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。

AIA是通過mBSA系統(tǒng)免疫動物并局部誘發(fā)關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生。由于炎癥局限于注射關(guān)節(jié)部位，AIA并不是RA的一個完整模型，但其原理可能適用于其他抗原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎中。mBSA是一種高密度陽離子蛋白質(zhì)，能被軟骨表面吸附，保留時間長，因此能長時間維持炎癥。此外，膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)有限的空間也可能導(dǎo)致mBSA誘發(fā)嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎。

目前，AIA的造模仍是在Brackertz方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)行適當(dāng)?shù)母牧迹⑽催M(jìn)行深入的研究。0 d時，在股骨頭對應(yīng)的外部皮膚皮內(nèi)注射100 μg mBSA與CFA的混合物；7 d時，在小鼠尾根部皮內(nèi)注射相同劑量的藥物；21 d時，在小鼠左腿的膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射10 μg mBSA與PBS的混合物，右腿的膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射同等劑量的PBS作為對照。

AIA模型雖然不是RA的完整模型，但對研究關(guān)節(jié)炎局部細(xì)胞之間的相互作用還是很有價值的[12]。

1.5 蛋白聚糖誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(Proteoglycan-induced arthritis，PGIA) 蛋白聚糖(Proteoglycan，PG)是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要大分子之一，與CⅡ相似。用PG免疫可以誘導(dǎo)遺傳易感的BALB/c小鼠產(chǎn)生嚴(yán)重的慢性關(guān)節(jié)炎。PGIA模型是由Glant[13]建立的。簡而言之，該模型中的關(guān)節(jié)炎是由各種來源分離的PG腹腔注射遺傳易感性小鼠而誘導(dǎo)的。通過該模型，研究者進(jìn)行了大量研究，以闡述PGIA免疫遺傳方面的機(jī)制，如確定T細(xì)胞識別表位和各種細(xì)胞因子的功能。PGIA中關(guān)節(jié)炎的發(fā)展歸因于對外源性PG和小鼠自身PG的交叉反應(yīng)。

盡管人軟骨是PG的優(yōu)選來源，但其提取和純化是一個非常復(fù)雜的步驟，且涉及倫理問題。Ishikawa等[14]評估了牛PG替代的可能性，其采用BALB/c小鼠，將牛PG與DDA乳化后腹腔注射，一共注射3次，每隔7 d 1次。結(jié)果顯示，3種劑量的牛PG+DDA免疫后都發(fā)展為關(guān)節(jié)炎。但就臨床疾病而言，其發(fā)生率低于人PG所誘導(dǎo)的模型。盡管如此，實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的關(guān)節(jié)炎組織學(xué)改變與人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎仍非常相似，結(jié)果表明，牛PG可以作為研究關(guān)節(jié)炎的另一抗原來進(jìn)行探索。

1.6 K/BxN血清轉(zhuǎn)移性關(guān)節(jié)炎(K/BxN serum transfer arthritis，K/BxN STA) K/BxN STA模型可以研究RA和其他關(guān)節(jié)炎發(fā)生的免疫機(jī)制。為了誘導(dǎo)K/BxN STA模型，將關(guān)節(jié)炎轉(zhuǎn)基因K/BxN小鼠的血清注射入正常小鼠體內(nèi)，幾天后便會出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀。

模型中的炎癥反應(yīng)是由自身抗原葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(Glucose-6-phosphate isomerase，G6PI)的自身抗體所導(dǎo)致免疫復(fù)合物(Immune complexes，ICs)的產(chǎn)生，從而驅(qū)動其他免疫細(xì)胞的產(chǎn)生。K/BxN STA引起的關(guān)節(jié)炎是一過性的，在10～14 d后達(dá)到峰值，并在接下來的幾周內(nèi)逐漸減退，但可以通過重復(fù)注射血清而持久。

G6PI存在于正常小鼠的踝關(guān)節(jié)表面，并且在關(guān)節(jié)炎小鼠中表達(dá)增加。研究發(fā)現(xiàn)，抗G6PI lgG會特異性定位于遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)，并在關(guān)節(jié)內(nèi)保持至少24 h[15]。這直接導(dǎo)致抗G6PI抗體結(jié)合正常小鼠體內(nèi)軟骨上的G6PI，從而形成ICs。而ICs的形成會促進(jìn)血液中嗜中性粒細(xì)胞的活化，進(jìn)而觸發(fā)血管活性介質(zhì)的釋放，增加血管的通透性[16]。中性粒細(xì)胞是K/BxN STA模型中的關(guān)鍵細(xì)胞類型，并且在關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。此外，通過促使中性粒細(xì)胞的持續(xù)募集，會釋放LTB4和IL-1β來加大關(guān)節(jié)炎反應(yīng)。除了中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞也在抗體依賴性成分(如ICs、補(bǔ)體和Fc受體)與關(guān)節(jié)炎進(jìn)展之間起著必要的聯(lián)系作用。在RA中，K/BxN STA模型是理解自身抗體如何通過與先天免疫系統(tǒng)的不同組分之間的相互作用來驅(qū)動關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的有用工具。

K/BxN STA模型具有一些明顯的優(yōu)點(diǎn)，其發(fā)病率高，重復(fù)性好，個體差異小。此外，該模型僅研究關(guān)節(jié)炎效應(yīng)階段，而不涉及免疫應(yīng)答啟動階段[17]，而且其也可用于關(guān)節(jié)炎疼痛方面的研究。

2 轉(zhuǎn)基因型

2.1 K/BxN 小鼠(K/BxN TCR-tg) RA的K/BxN小鼠模型是偶然間發(fā)現(xiàn)的。1996年，研究人員發(fā)現(xiàn)，在C57BL/6xNOD遺傳背景下的KRN TCR-tg小鼠會發(fā)生關(guān)節(jié)病變，從3周左右開始迅速惡化直至小鼠的運(yùn)動性能受到嚴(yán)重?fù)p害。小鼠身上會表現(xiàn)出人類的主要組織學(xué)特征：滑膜炎，軟骨和骨質(zhì)破壞，以及無規(guī)則的重塑。隨后的研究表明，該疾病是由T、B細(xì)胞對G6PI的自身免疫所引起的。盡管小鼠模型與人類有明顯的相似之處，但確實(shí)存在一些細(xì)節(jié)上的分歧：小鼠癥狀更具侵襲性，特定關(guān)節(jié)受到的影響不同，產(chǎn)生不同的自身抗體。盡管如此，考慮到疾病的相似性、發(fā)病率高和重復(fù)性好的特點(diǎn)，K/BxN小鼠模型對于闡明RA的發(fā)病機(jī)制具有非常重要的價值。近年來，針對這種模型的研究不多，但在2012年，Auger等[18]研究發(fā)現(xiàn)，不完全的TCRβ等位基因排除可以增強(qiáng)自身反應(yīng)性T細(xì)胞的陽性選擇，并加速K/BxN TCR轉(zhuǎn)基因小鼠中的自發(fā)性自身免疫性關(guān)節(jié)炎。

2.2 人TNF-α轉(zhuǎn)基因小鼠(huTNF-α-tg) 在1991年，Keffer等通過修飾基因3′末端，從而導(dǎo)致人TNF-α表達(dá)升高。該模型從3～4周齡開始便伴有踝關(guān)節(jié)腫脹，9周左右出現(xiàn)關(guān)節(jié)破壞。組織學(xué)上，滑膜增生和細(xì)胞浸潤出現(xiàn)較早，隨后形成血管翳，進(jìn)而出現(xiàn)軟骨、骨破壞及纖維化。這種模型具有遺傳因素。該品系最早在C57BL/6×CBA背景上獲得，后回交到DBA/1背景上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其會導(dǎo)致發(fā)病較早且更嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎[19]。這個模型通常用來研究關(guān)節(jié)炎中TNF-α參與的相關(guān)發(fā)病機(jī)制。此外，該模型也是唯一的測試抗人TNF-α質(zhì)量效果的模型[20]。

2.3 IL-1 受體拮抗劑基因敲除小鼠(IL-1ra) IL-1ra基因敲除小鼠在5～8周時會發(fā)展為關(guān)節(jié)炎，其主要特征是炎性浸潤、血管翳形成和關(guān)節(jié)侵蝕。該模型只能在BALB/c背景上實(shí)現(xiàn)，而無法在B6背景上。Akitsu等[21]研究發(fā)現(xiàn)，IL-1ra基因敲除小鼠的CCR2(+)Vγ6(+)γδ T細(xì)胞會發(fā)生內(nèi)在激活，優(yōu)先產(chǎn)生IL-17，從而誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。研究還發(fā)現(xiàn)，在這個模型中，適應(yīng)性和先天性免疫是以協(xié)調(diào)的方式來共同誘導(dǎo)自身免疫性疾病。Deng等[22]對IL-1ra基因敲除小鼠的基因序列進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，遺傳因子可以通過對1號染色體上QTL的影響來改變自發(fā)性關(guān)節(jié)炎的易感性。因此，QTL區(qū)域內(nèi)遺傳因子的相關(guān)研究將有助于闡明自發(fā)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制。

2.4 SKG小鼠 SKG小鼠是在BALB/c背景下，ZAP-70基因位點(diǎn)發(fā)生突變而培育出來的。ZAP-70是一種對T細(xì)胞信號傳導(dǎo)起重要作用的分子，其在小鼠中的突變會影響T細(xì)胞的功能選擇。SKG小鼠關(guān)節(jié)炎的特點(diǎn)是小關(guān)節(jié)對稱性炎癥、類風(fēng)濕性因子升高和進(jìn)行性關(guān)節(jié)破壞，與人類的RA相似。除了關(guān)節(jié)外的病變，該模型還出現(xiàn)肺炎、皮炎等病變。因此，該模型比較適合用來研究RA發(fā)展與T細(xì)胞的關(guān)系[23]。此外，該模型還常被用來評估藥物對RA中骨骼變化的作用。

3 總結(jié)與展望

目前，鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的模型很多，且其在誘導(dǎo)模式和敏感性等方面各不相同，本文主要介紹了一些廣泛使用的鼠關(guān)節(jié)炎模型。在上述模型中，CIA建立較早，也較為成熟，但其缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)操作，容易導(dǎo)致造模成功率不同。相對于CIA，DTHA起病更急，但關(guān)節(jié)炎只存在于一只爪子中。DTHA中的疾病是自限性的，而RA是慢性進(jìn)行性的，因此該模型比較適合研究導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎發(fā)展的早期炎癥的機(jī)制。

AIA是使用mBSA誘導(dǎo)的另一種模型，在單膝關(guān)節(jié)內(nèi)給予mBSA，與DTHA免疫方法不同。由于mBSA能長時間停留在關(guān)節(jié)腔內(nèi)，相對于DTHA，AIA可長時間維持炎癥。由于DTHA和AIA都是在特定位置被誘導(dǎo)，會以不對稱的方式影響關(guān)節(jié)，因此比較容易直觀地比較藥物對關(guān)節(jié)炎的影響。CAIA的疾病表現(xiàn)與CIA和DTHA相似，但發(fā)病率和嚴(yán)重程度較低，且需要更多的抗體來誘導(dǎo)，缺乏成本優(yōu)勢。除了這些誘導(dǎo)型，一些轉(zhuǎn)基因小鼠也是RA中很重要的模型。huTNF-α-tg可以用來深入研究TNF-α下游相關(guān)關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制。SKG小鼠可以用來研究T細(xì)胞功能對RA的影響。

綜上所述，每個模型都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，需要我們進(jìn)行深入研究，探索出一種更經(jīng)濟(jì)簡便、與人RA疾病特點(diǎn)相符的模型。

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