PPAR?γ激動(dòng)劑對(duì)哮喘小鼠氣道重塑的影響

陳治宇，王宋平（.西南醫(yī)科大學(xué)，四川瀘州646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)一科，四川瀘州646000）

過(guò)氧化物酶增值物激活受體（PPAR）是核受體超家族成員，按照編碼基因的不同，主要分為PPAR?α、PPAR?β 及 PPAR?γ。PPAR?γ 主要通過(guò)與激動(dòng)劑結(jié)合發(fā)揮相應(yīng)的作用，吡格列酮是PPAR?γ合成激動(dòng)劑之一。近年研究發(fā)現(xiàn)，格列酮類藥物能抑制免疫因子的合成和釋放[1]，從而對(duì)肺部疾病達(dá)到明顯的抗炎作用。目前的研究大多是關(guān)于PPAR?γ激動(dòng)劑對(duì)哮喘的抗炎作用[2]，有關(guān)氣道重塑研究較少，且相關(guān)作用機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)建立慢性哮喘小鼠模型，探討PPAR?γ激動(dòng)劑吡格列酮對(duì)慢性哮喘氣道重塑的作用及對(duì)肺組織中ADPN表達(dá)影響，從而為臨床應(yīng)用PPAR?γ激動(dòng)劑治療哮喘奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般材料 選取6～8周齡雌性C57小鼠24只，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自重慶騰鑫公司。卵清蛋白（OVA）（美國(guó)Sigma公司）、氫氧化鋁、鹽酸吡格列酮片（天津武田藥品有限公司）、小鼠PPAR?γ單克隆抗體購(gòu)自Ab?cam公司提供、SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒（TaKaRa公司）、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀購(gòu)自杭州博日科技公司、StepOne? Real?Time PCR 儀購(gòu)自 Life technologies公司。

1.2 方法

1.2.1 慢性哮喘小鼠氣道重塑模型 采用編號(hào)抽簽法，將小鼠分為哮喘組（OVA組）、藥物組（OVA+ROSI組）、正常對(duì)照組（Con組），每組8只。參考文獻(xiàn)[3-4]報(bào)道的方法，并加以改進(jìn)制作哮喘模型。OVA組和OVA+ROSI組在0、7、14 d腹腔注射0.2 mL生理鹽水致敏液[OVA 25μg和氫氧化鋁1 mg]致敏，第21天對(duì)OVA、OVA+ROSI組經(jīng)腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，經(jīng)鼻滴入0.2%OVA溶液，每只20μL，每周3次，持續(xù)8周，Con組給予相同容積生理鹽水致敏和激發(fā)，OVA+ROSI組每次激發(fā)前 1 h 給予吡格列酮[10 mg（kg·d）]灌胃，Con組、OVA組給予相同容積生理鹽水灌胃對(duì)照。

1.2.2 肺組織的處理 末次滴鼻24 h后，應(yīng)用戊巴比妥鈉溶液處死小鼠，取左肺用4%多聚甲醛溶液固定、常規(guī)制備病理石蠟切片，HE染色后鏡下觀察各組肺組織中氣道上皮損傷、脫落程度，支氣管氣道壁增厚程度。

1.2.3 氣道重塑相關(guān)指標(biāo)測(cè)量 Masson染色觀察膠原沉積程度，使用圖像分析軟件Image?Pro Plus測(cè)量氣道膠原沉積的面積，并測(cè)氣道壁相關(guān)值，每個(gè)樣本中依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[5]中有關(guān)氣道各層的定義，選取相對(duì)數(shù)量的中小支氣管，分別測(cè)量平滑肌內(nèi)緣內(nèi)氣管面積（Wam1）、平滑肌外緣內(nèi)氣管面積（Wam2），支氣管管腔總面積（Wat1）、支氣管總面積（Wat2）、支氣管基底膜周徑（Pbm），使用Pbm標(biāo)準(zhǔn)化，支氣管氣道壁厚度用（Wat2?Wat1）/Pbm 表示，支氣管平滑肌厚度用（Wam2?Wam1）/Pbm表示。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real?time PCR）檢測(cè)肺組織PPAR?γ、AdipoRs mRNA表達(dá) 提取肺組織總 RNA做逆轉(zhuǎn)錄，用 PPAR?γ、AdipoRs引物進(jìn)行 RT?PCR 檢測(cè)。PPAR?γ 的上游引物 為 5′?GCTTGTGAAGGATG?CAAGGG?3′，下游引物 為 5′?GATATCACTGGAGA?TCTCCGCC?3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為 225 bp；AdipoR1的上游引物 為 5′?GGGACTTGGCTTGAGTGGTG?3′下游引物 為 5′?AAGTGGACGAAAGCTGCTGC?3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為240 bp；AdipoR2的上游引物為5′?TAG?GCCTGAGTGGAATCATCC?3′，下游引物為 5′?CAG?CAACCACAAAGATGTGGA?3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為219 bp；以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參照物，上游引物為 5′?TGAAGGGTGGAGCCAAAAG?3′，下游引物為 5′?AGTCTT?CTGGGTGGCAGTGAT?3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為227 bp。上述引物均由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司合成。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blotting）檢測(cè)肺組織中PPAR?γ及ADPN的表達(dá) 取小鼠肺組織100 mg，提取總蛋白后，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，小鼠PPAR?γ、ADPN一抗孵育，采用HRP標(biāo)記的二抗，以ECL發(fā)光液顯色，采用AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，呈正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者采用Dunnett?t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺組織病理改變 HE染色顯微鏡下可見(jiàn)Con組小鼠氣道上皮結(jié)構(gòu)完整，未發(fā)現(xiàn)氣道上皮結(jié)構(gòu)破壞。OVA+ROSI組小鼠氣道上皮結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，仍可見(jiàn)少許氣道上皮脫落，病理改變較哮喘組減輕，但較Con組病理改變加重，OVA組氣道上皮管腔可見(jiàn)少許分泌物，支氣管壁增厚，支氣管平滑肌肥大，黏膜下水腫，黏膜皺褶增多，氣道上皮多處斷裂和上皮細(xì)胞脫落，見(jiàn)圖1。

圖1 各組肺組織病理改變（HE染色，100×）

2.2 利用Masson染色分析測(cè)量氣道重塑相關(guān)情況Masson染色結(jié)果顯示，OVA組氣道上皮下膠原沉積明顯增多，病理改變明顯，而OVA+ROSI組膠原沉積量較OVA組減少，但仍比Con組多（圖2）。經(jīng)Image?Pro Plus圖像分析軟件測(cè)定后，Con組膠原沉積面積最少，所占比例為8.75%，OVA組膠原沉積所占面積44.71%，較Con組明顯擴(kuò)大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而OVA+ROSI組膠原沉積面積比約為23.48%，較OVA組減少，仍較Con組面積擴(kuò)大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖 3。

圖2 各組肺組織病理改變（Masson染色，100×）

圖3 各組肺組織氣道上皮膠原沉積面積

2.3 利用氣道壁厚度變化表示氣道重塑程度 利用Image?Pro Plus圖像分析軟件結(jié)果顯示，Con組小鼠氣道壁及支氣管平滑肌厚度測(cè)值最低，與Con組比較，OVA組小鼠的氣道壁厚度和平滑肌厚度明顯增厚，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），氣道重塑明顯，與Con組比較，OVA+ROSI組小鼠氣道壁厚度和平滑肌厚度減輕，與Con組相比仍升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠支氣管壁、平滑肌厚度比較（±s，μm）

表1 各組小鼠支氣管壁、平滑肌厚度比較（±s，μm）

注：與 Con組比較，aP＜0.01；與 OVA 組比較，bP＜0.01

組別Con組OVA組OVA+ROSI組n8 8 8支氣管壁厚度15.39±0.83 32.18±0.76a 23.84±0.91ab平滑肌厚度3.42±0.27 11.46±1.86a 7.70±0.16ab

2.4 RT?PCR 檢測(cè)各組肺組織 AdipoR1、AdipoR2、PPAR?γ mRNA表達(dá)水平 以GAPDH作為內(nèi)參，OVA+ROSI組 PPAR?γ、AdipoR1、AdipoR2 mRNA 水平表達(dá)均明顯高于Con組、OVA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），OVA 組 AdipoR1、AdipoR2 mRNA 水平表達(dá)均較Con組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），OVA組 PPAR?γ水平表達(dá)較Con組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 RT?PCR檢測(cè)各組肺組織AdipoR1、AdipoR2、PPAR?γ mRNA水平表達(dá)比較（±s）

表2 RT?PCR檢測(cè)各組肺組織AdipoR1、AdipoR2、PPAR?γ mRNA水平表達(dá)比較（±s）

注：與 Con組相比，aP＜0.01；與 OVA 組比較，bP＜0.01

組別Con組OVA組OVA+ROSI組n8 8 8 Adipor1/GAPDH 0.99±0.125 0.44±0.073a 1.88±0.051ab Adipor2/GAPDH 1.00±0.117 0.46±0.073a 3.13±0.130ab PPARγ/GAPDH 0.96±0.026 2.12±0.147a 4.28±0.164ab

2.5 Western blotting測(cè)定各組肺組織中PPAR?γ蛋白及脂聯(lián)素（ADPN）的表達(dá) 與Con組比較，OVA組及OVA+ROSI組中 PPAR?γ表達(dá)增加，OVA+ROSI組較OVA組明顯，肺組織中ADPN表達(dá)的檢測(cè)中，OVA組較Con組表達(dá)減少，OVA+ROSI組較Con組表達(dá)增加，見(jiàn)圖4，具體分析結(jié)果見(jiàn)圖5、6。

圖4 Western blotting測(cè)定肺組織中PPAR?γ蛋白及ADPN的表達(dá)

圖5 Western blotting測(cè)定肺組織中PPAR-γ蛋白的相對(duì)表達(dá)

圖6 Western blotting測(cè)定肺組織中ADPN的相對(duì)表達(dá)

3 討 論

支氣管哮喘的主要病理變化包括氣道炎癥及氣道重塑，氣道炎癥引發(fā)氣道高反應(yīng)性，通過(guò)釋放細(xì)胞因子致使支氣管痙攣，氣道重塑主要表現(xiàn)為氣道壁增厚、氣道平滑肌增生肥大、氣道管腔縮窄、黏膜下新生血管形成、黏膜肥厚增生等改變。氣道重塑引起氣道不可逆阻塞性病變，是導(dǎo)致哮喘病情加重的重要因素之一。

吡格列酮屬于格列酮類藥物，為過(guò)氧化物酶增值物激活受體?γ合成類激動(dòng)劑，臨床上主要作用于脂肪細(xì)胞。作為2型糖尿病及代謝綜合征的治療靶點(diǎn)，PPAR?γ是一類由激動(dòng)劑激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于Ⅱ型核受體超家族成員。目前研究發(fā)現(xiàn)，PPAR?γ激動(dòng)劑主要分為天然激動(dòng)劑和合成激動(dòng)劑[6]。PPAR?γ廣泛分布于氣道上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞中，具有一定抑制哮喘炎癥的作用[7]，可能是通過(guò)以下相關(guān)途徑發(fā)揮作用：（1）PPAR?γ通過(guò)與激動(dòng)劑結(jié)合后，使PPAR?γ磷酸化，磷酸化后的PPAR?γ參與到MAPK和PI3K相關(guān)通路調(diào)節(jié)；（2）PPAR?γ與激動(dòng)劑結(jié)合后，與過(guò)氧化物酶增殖子效應(yīng)原件（PPRE）相互作用，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯等生物學(xué)效應(yīng)并參與脂質(zhì)代謝，細(xì)胞分化、增殖、凋亡；（3）PPAR?γ 通過(guò)抑制核因子?κB（NF?κB），活化蛋白?1（AP?1）等相關(guān)因子[8]，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示，與OVA組小鼠比較，OVA+ROSI組小鼠氣道上皮細(xì)胞損傷程度、膠原沉積面積、氣道壁厚度、平滑肌厚度減輕，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；OVA+ROSI組小鼠肺組織 PPAR?γ、AdipoR1 和AdipoR2 mRNA、ADPN表達(dá)水平較OVA組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；OVA 組 AdipoR1和 Adi?poR2 mRNA、ADPN表達(dá)水平較Con組降低，PPAR?γ表達(dá)水平較Con組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；OVA組小鼠氣道炎癥及重塑情況較Con組加重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。表明吡格列酮可降低哮喘小鼠氣道炎性反應(yīng)，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]，本研究還發(fā)現(xiàn)，吡格列酮可改善哮喘小鼠氣道重塑，其機(jī)制可能是激活PPAR?γ促進(jìn)AdipoRs基因轉(zhuǎn)錄完成，進(jìn)而激活A(yù)MPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，抑制NF?κB活性，從而抑制樹(shù)突狀細(xì)胞向肺組織遷移，抑制肺組織中嗜酸粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，減輕肺部炎癥[10?11]，還可以減少血管通透性，還可以通過(guò)下調(diào)小鼠肺組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A和缺氧誘導(dǎo)因子等相關(guān)因子，同時(shí)也可提高哮喘小鼠抗炎因子IL?10水平、降低肺組織Th2炎性因子水平和ROS水平，從而達(dá)到抗炎及抑制氣道重塑的作用。PPAR?γ激動(dòng)劑對(duì)哮喘氣道的黏液分泌也有一定作用，有相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，PPAR?γ也可以通過(guò)抑制MUC5AC表達(dá)，進(jìn)而抑制氣道黏液分泌，從而對(duì)哮喘有一定的治療作用[12?14]，同時(shí)也發(fā)現(xiàn) PPAR?γ 激動(dòng)劑通過(guò)下調(diào)CyclinD1的表達(dá)，或者是表達(dá)相關(guān)負(fù)調(diào)控蛋白并抑制CyclinD1的活性，抑制哮喘氣道炎癥及氣道重塑[15]。

OVA組PPAR?γ表達(dá)水平較Con組升高，哮喘時(shí)PPAR?γ升高是機(jī)體的一種反饋抑制作用，是對(duì)氣道炎癥的應(yīng)答，主要機(jī)制可能是由于PPAR?γ作為核轉(zhuǎn)錄受體，在正常生理?xiàng)l件下在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)與輔遏制子結(jié)合，無(wú)生物活性，激動(dòng)劑進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)與PPAR?γ結(jié)合，PPAR?γ通過(guò)結(jié)構(gòu)改變脫離輔遏制子，進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)合輔激活子，并與PPRE結(jié)合調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的活性。只有PPAR?γ進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)時(shí)，才具有生物活性，與相關(guān)研究報(bào)道一致[16]，OVA組PPAR?γ的表達(dá)主要以細(xì)胞質(zhì)為主；而激動(dòng)組PPAR?γ主要在細(xì)胞核中表達(dá)，所以PPAR?γ激動(dòng)劑并不是通過(guò)進(jìn)一步提高體內(nèi)PPAR?γ的含量，而是通過(guò)促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位而增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。OVA組主要是細(xì)胞質(zhì)中PPAR?γ升高，未進(jìn)入細(xì)胞核，無(wú)生物活性[17]。在哮喘小鼠中，PPAR?γ激動(dòng)劑有一定的抗炎、抑制氣道黏液分泌及抑制氣道重塑的作用，為臨床應(yīng)用PPAR?γ激動(dòng)劑治療哮喘提供理論依據(jù)，但作用機(jī)制尚不完全明確，還需進(jìn)一步完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)明確具體機(jī)制。

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