蒜氨酸在家兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究*

李明強(qiáng)，胡 銘，韓志俊，李恒梅，宋姍姍（遵義醫(yī)學(xué)院：.微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，.臨床醫(yī)學(xué)系，貴州遵義563003）

蒜氨酸為大蒜素前體物質(zhì)存在于大蒜中，為水溶性的氨基酸類化合物，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在蒜酶的作用下分解成大蒜素。由于大蒜素脂溶性和刺激性，在制劑制備過程中必須使用脂溶劑、增溶劑，對(duì)機(jī)體造成毒性反應(yīng)，導(dǎo)致大蒜素臨床制劑（大蒜素注射液）至今未得到廣泛應(yīng)用。但是大蒜素高效、廣泛的生物學(xué)效應(yīng)吸引學(xué)者對(duì)其進(jìn)行更加深入的研究，希望能得到更好的大蒜素制劑，使其更好地應(yīng)用于臨床[1]。近年來，體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素與蒜氨酸都具有抗微生物、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)及防治心血管病作用[2?5]，也逐漸成為人們對(duì)大蒜生物活性成分的研究熱點(diǎn)。對(duì)蒜氨酸制劑的研究多局限于將蒜氨酸與蒜酶共同使用，在消化道蒜酶分解蒜氨酸為大蒜素，吸收大蒜素發(fā)揮藥效作用[6]，但鮮見蒜氨酸制劑研究，以及蒜氨酸在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究報(bào)道。本文就蒜氨酸在家兔體內(nèi)的血藥濃度變化、分布及在體內(nèi)代謝物情況進(jìn)行研究，以期為蒜氨酸的應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料 （1）動(dòng)物：健康家兔20只，由本單位動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。（2）試劑：蒜氨酸為本實(shí)驗(yàn)室制備，10%鎢酸鈉（10 g鎢酸鈉加蒸餾水100 mL溶解），0.333 mol/L硫酸溶液（蒸餾水290 mL加入98%濃硫酸10 mL，逐滴緩慢加入），三氯醋酸，正己烷，鹽酸，甲醇。（3）標(biāo)準(zhǔn)品蒜：氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，含量98%，國(guó)家指定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，由上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品編號(hào)：YY91270；大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品，含量98%，國(guó)家指定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，由上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品編號(hào)：PCS0325。實(shí)驗(yàn)用蒜氨酸由本實(shí)驗(yàn)室提取。（4）儀器：設(shè)備離心機(jī)、組織勻漿機(jī)、安捷倫1200型液相色譜分析儀、高速臺(tái)式離心機(jī)、旋渦混合器。

1.2 方法 取健康家兔20只，稱體重，檢查健康狀況，給藥前24h禁止喂食蒜、蔥類植物，分為兩組，每組10只。組1用100 mg/L蒜氨酸溶液，按100 mg/kg劑量耳緣靜脈注射給藥，注射給藥后 10、30 min，1、3、6、12 h 自兔子耳靜脈采血約2 mL，并立即進(jìn)行標(biāo)本處理。組2在完成組1實(shí)驗(yàn)后，按100 mg/kg劑量給予組2家兔耳緣靜脈注射100 mg/L的蒜氨酸溶液，根據(jù)組1大蒜素檢測(cè)結(jié)果，在血藥濃度高峰期時(shí)，經(jīng)心臟采血致家兔死亡，分別取肝、腎、肺、腦組織勻漿，按1.2.1和1.2.2檢測(cè)蒜氨酸和大蒜素含量。

1.2.1 蒜氨酸檢測(cè) 標(biāo)本處理在無大分子兩性電離物質(zhì)蛋白質(zhì)存在的條件下，參照文獻(xiàn)[7]分離沉淀蒜氨酸，再用標(biāo)本體積蒸餾水溶解蒜氨酸進(jìn)行色譜分析。采用鎢酸蛋白沉淀法制備無蛋白濾液：取蒸餾水5 mL，吸取抗凝血1 mL，擦去吸管壁外血液，緩緩將血液放入蒸餾水，將吸管提高，吸取上清液反復(fù)沖洗吸管3次。充分混合，使紅細(xì)胞完全溶解；加入0.333 mol/L硫酸溶液1 mL，充分混勻，此時(shí)血液由鮮紅變成棕色，靜置5～10 min，使其酸化完全；加入10%鎢酸鈉1 mL，邊加邊搖，放置約5 min后，如振搖也不再出現(xiàn)泡沫，說明蛋白質(zhì)已完全變性沉淀；以2 500 r/min離心10 min，即得完全澄清無色之無蛋白血濾液。吸出透明液體，用1 mol/L氫氧化鈉溶液0.3 mL調(diào)節(jié)無蛋白濾液的pH至3.0，析出蒜氨酸，再以4 000 r/min離心20 min，沉淀用1 mL三蒸水溶解，微孔濾膜過濾，進(jìn)行色譜分析。

色譜分析參照文獻(xiàn)[7]色譜條件：Eclipse XDB?C18（150.0 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱；流動(dòng)相為水∶乙腈（85∶15）；流速為 0.5 mL/min；柱溫為 25℃；進(jìn)樣 20μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分別稱取蒜氨酸24.300 mg，加入1 mL蒸餾水，為24.300 mg/mL蒜氨酸溶液標(biāo)準(zhǔn)液，再用蒸餾水稀釋成24.300 00、12.150 00、1.215 00、0.121 50、0.012 15 mg/mL 蒜氨酸溶液。取上述濃度的蒜氨酸溶液0.1 mL分別置于加入0.9 mL兔血液標(biāo)本中，再按血液標(biāo)本處理，進(jìn)行液相色譜分析，進(jìn)樣20μL，記錄色譜圖及峰面積。以蒜氨酸的濃度X（μg/mL）為縱坐標(biāo)，峰面積積分值Y為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 大蒜素檢測(cè) 標(biāo)本處理：參照文獻(xiàn)[8]血樣品預(yù)處理，取0.7 mL血漿加入10%三氯醋酸溶液0.2 mL，振蕩1 min，精密加入正己烷1 mL，渦旋3 min提取藥物，以4 000 r/min離心15 min，取上清液，0.45μm微孔率膜過濾，進(jìn)行液相色譜分析，進(jìn)樣20μL。

色譜分析參照文獻(xiàn)[9]色譜條件：Eclipse XDB?C18（150.0 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈∶水=85∶15，流速為 0.5 mL/min；柱溫為 20℃；進(jìn)樣 20μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：取20 mg/mL大蒜素0.5 mL與0.5 mL二甲基亞砜，溶解為10 mg/mL大蒜素溶液，再用蒸餾水稀釋為 1.00、0.10、0.01 mg/mL。分別取 20.00、10.00、1.00、0.10、0.01 mg/mL 大蒜素溶液，取 0.1 mL 各濃度溶液分別置于加入0.9 mL兔血漿標(biāo)本中，混勻靜止10 min，取此血漿0.7 mL，按上法預(yù)處理，進(jìn)行色譜分析。以峰面積（A）為橫坐標(biāo)，大蒜素濃度（C）為縱坐標(biāo)，回歸得到大蒜素在血漿中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 蒜氨酸檢測(cè) 蒜氨酸濃度與其峰面積均呈良好的線性關(guān)系，R2=0.999 9，見圖1。

圖1 蒜氨酸濃度?峰面積制備標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 大蒜素檢測(cè) 大蒜素濃度與其峰面積具良好線性關(guān)系，R2=0.997 3，見圖 2。

圖2 大蒜素濃度?峰面積制備標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 蒜氨酸血藥濃度隨時(shí)間的變化過程 變化過程符合二房室一級(jí)動(dòng)力學(xué)過程，見圖3。主要的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)：曲線下面積（AUC）為 16 964.0（mg·min）/L，K12為0.002 92，K21為 0.003 6，半衰期（t1/2（12））為 237.3 min，t1/2（21）為 192.5 min，表觀分布容積（Vd）為 4.912 L，清除率（Cl）為0.0 177 mg/（L?min）。

圖3 蒜氨酸血藥濃度?時(shí)間變化曲線

圖4 大蒜素血藥濃度?時(shí)間變化曲線

2.4 大蒜素血藥濃度的變化過程 變化過程為二房室一級(jí)動(dòng)力學(xué)過程見圖4，主要藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)：AUC為12 583.1（mg·min）/L，Ka為 0.030 50，K12為 0.003 05，K21為 0.002 66，t1/2（12）為 227.2 min，t1/2（21）為 260.53 min，Vd為4.51 L，Cl為0.012 mg/（L?min）。

2.5 家兔血液與器官組織中蒜氨酸和大蒜素濃度比較 注射蒜氨酸、大蒜素溶液1 h后經(jīng)心臟采血致家兔死亡，血液、肝、腎、肺、腦組織中蒜氨酸與大蒜素結(jié)果見表1。肝臟中的蒜氨酸、大蒜素濃度均高于血液，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；肺組織中大蒜素濃度明顯低于血液，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中蒜氨酸濃度與血液比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；腎、大腦組織中蒜氨酸、大蒜素濃度與血液比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 家兔血液與器官組織中蒜氨酸、大蒜素濃度比較（±s，μg/mL）

表1 家兔血液與器官組織中蒜氨酸、大蒜素濃度比較（±s，μg/mL）

注：-表示無此項(xiàng)

標(biāo)本名血液t -P-t -P-肝肺腎腦＜0.01＜0.01＞0.05＞0.05標(biāo)本數(shù)10 10 10 10 10蒜氨酸47.22±3.50 53.23±3.80 46.32±3.60 46.12±3.50 45.89±3.50 4.998-0.79-0.993-1.201＜0.01＞0.05＞0.05＞0.05大蒜素35.32±3.20 39.78±3.60 22.61±3.10 34.01±3.30 36.62±3.20 3.915-12.956-1.254 1.284

3 討 論

血液蒜氨酸檢測(cè)，標(biāo)本處理根據(jù)血液生化檢驗(yàn)無蛋白濾液制備與文獻(xiàn)[7]蒜氨酸等電點(diǎn)相結(jié)合分離蒜氨酸，根據(jù)蒜氨酸紫外吸收光譜進(jìn)行色譜分析，得到蒜氨酸濃度?時(shí)間曲線為二房室一級(jí)動(dòng)力學(xué)過程，與文獻(xiàn)[10]報(bào)道相符。文獻(xiàn)[10]報(bào)道的是小鼠灌胃給藥，具有吸收分布曲線，而本文采用靜脈注射給藥，無吸收分布曲線。大蒜素為脂溶性物質(zhì)，標(biāo)本中大蒜素的分離參照文獻(xiàn)[8]采用有機(jī)溶劑正己烷萃取，微孔濾膜過濾，參照文獻(xiàn)[9]根據(jù)大蒜素紫外吸收光譜進(jìn)行色譜分析，結(jié)果大蒜素血藥濃度?時(shí)間變化曲線為二房室一級(jí)動(dòng)力學(xué)過程，與文獻(xiàn)[8]報(bào)道相符。文獻(xiàn)[8]報(bào)道的乙二醇單甲醚磷脂酰乙醇胺衍生物（PEG?PE）修飾的大蒜素長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體（PEG?DATS?LCL）延緩了大蒜素在體內(nèi)的釋放，顯著延長(zhǎng)了大蒜素半衰期，而大蒜素注射液的大蒜素血藥濃度?時(shí)間變化曲線與本研究報(bào)道基本一致。

蒜氨酸為大蒜主要氨基酸成分，在蒜酶的作用下分解為大蒜素。有研究表明，蒜氨酸在不同溫度條件下蒜氨酸熱分解產(chǎn)物為二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、二烯丙基四硫醚等大蒜素成分，但并不影響抗氧化活性[11?13]。本研究結(jié)果顯示，蒜氨酸進(jìn)入機(jī)體后，在血液中檢測(cè)有大蒜素存在，說明蒜氨酸進(jìn)入機(jī)體內(nèi)，在代謝酶的作用下，分解生成大蒜素，并發(fā)揮蒜氨酸和大蒜素雙重藥物的藥理作用。表明蒜氨酸在蒜酶、代謝酶和高溫裂解作用下產(chǎn)物均為大蒜素。在代謝過程中，蒜氨酸分解代謝，生成大蒜素。本研究中蒜氨酸 AUC 為 16 964.0（mg·min）/L，高于大蒜素的12 583.1（mg·min）/L。蒜氨酸與大蒜素的 Vd 均大于 3，二者均為體液分布。

本研究結(jié)果顯示，蒜氨酸血藥濃度較高時(shí)，代謝較快，血藥濃度快速下降，大蒜素血藥濃度快速升高，當(dāng)大蒜素濃度接近蒜氨酸濃度后，蒜氨酸代謝速度減慢，保持蒜氨酸濃度高于大蒜素濃度；符合物質(zhì)代謝酶促反應(yīng)的特點(diǎn)，當(dāng)反應(yīng)物濃度較高時(shí)，反應(yīng)速度加快，生成物濃度升高，抑制正向反應(yīng)速度[18]，最后蒜氨酸完全代謝轉(zhuǎn)化為大蒜素，以大蒜素形式排出體外，24 h后血液中未檢測(cè)出蒜氨酸和大蒜素，所以蒜氨酸t(yī)1/2均大于大蒜素t1/2，蒜氨酸Cl為0.017 7 mg/（L?min），高于大蒜素的0.012 mg/（L?min）。

組織器官中蒜氨酸與大蒜素結(jié)果顯示，肝臟能富集蒜氨酸，并在肝臟中轉(zhuǎn)化為大蒜素，在肝臟中蒜氨酸和大蒜素濃度均高于血液濃度，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。蒜氨酸是氨基酸成分在腎臟不能排泄，大蒜素為脂溶性成分也不在腎臟排泄，腎組織中蒜氨酸和大蒜素與血液比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。肺部組織中蒜氨酸濃度與血液比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；大蒜素為脂溶性揮發(fā)性成分，隨氣體揮發(fā)由呼吸道排出體外，其濃度顯著低于血液，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與文獻(xiàn)[12]報(bào)道相符。蒜氨酸和大蒜素都是小分子物質(zhì)，能夠通過血?腦屏障而進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，所以腦組織中的濃度與血液比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

綜上所述，蒜氨酸為食用藥物大蒜氨基酸類化合物，對(duì)機(jī)體物無毒性反應(yīng)；水溶性利于制劑制備，能提高藥物濃度，發(fā)揮有效的藥理作用；進(jìn)入機(jī)體后可生成大蒜素，具有雙重藥理作用，在體內(nèi)無藥物累積和殘留。由此可見，蒜氨酸有望成為深受臨床歡迎，治療多種疾病的藥物。

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