骨橋蛋白在COPD大鼠氣道重塑中的作用及阿奇霉素干預效應實驗研究*

樊 梅，鄧 俊，王宋平（西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院呼吸內一科，四川瀘州646000）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種具有氣流受限特征、可以預防和干預的疾病，其氣流受限不完全可逆、呈進行性發(fā)展，與肺臟對吸入煙草煙霧等有害氣體或顆粒的異常炎性反應有關，主要累及肺臟，造成患者肺功能受損以致呼吸衰竭及相關并發(fā)癥的發(fā)生，嚴重影響患者的生命健康及生活質量[1]。氣道重塑是造成COPD不可逆氣流受限的主要病理基礎，由于慢性炎癥導致氣道壁損傷和修復的反復發(fā)生而形成[2]。骨橋蛋白（OPN）是一種多功能磷酸化糖蛋白，作為一種新型的細胞因子和細胞外基質蛋白，廣泛參與骨代謝、心血管病變、免疫應答、腫瘤形成與轉移等過程[3]。近年來，OPN在炎癥、損傷修復、氣道重塑過程中的作用逐漸引起人們的重視。SIMOES等[4]研究發(fā)現，在哮喘模型中OPN可誘導基底膜增厚，促進氣道重塑。因此，OPN是否也同樣參與了COPD的氣道重塑過程，值得進一步探討。近年來研究證實，阿奇霉素具有抗炎、免疫調節(jié)、抑制氣道黏液分泌等作用，但阿奇霉素是否具有抑制COPD氣道重塑的作用尚鮮有報道。本實驗旨在觀察骨橋蛋白在COPD大鼠氣道重塑中的作用及阿奇霉素的干預效應，為應用阿奇霉素治療COPD提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 一般材料 脂多糖（美國Sigma公司），阿奇霉素（歐意藥業(yè)有限公司），天下秀牌香煙（焦油量：10 mg，煙堿量：1.0 mg，一氧化碳量：11 mg，四川中煙工業(yè)有限責任公司）；大鼠OPN酶聯免疫吸附測定試劑盒（伊萊瑞特生物科技有限公司），二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），10×乙二胺四乙酸（EDTA）修復液（Aspen公司），牛血清清蛋白（BSA，Roche瑞士羅氏公司）、兔抗鼠OPN抗體（Abcam公司）等。

1.2 方法

1.2.1 建立COPD大鼠模型 將18只健康雄性SD大鼠（購自西南醫(yī)科大學實驗中心），體重180～200 g，隨機分為對照組（C組）、COPD模型組（M組）、阿奇霉素藥物干預組（A組），每組6只。M組：采用熏香煙加氣管內滴注脂多糖的方法建立COPD模型：第1、14天，經氣管滴注脂多糖200μg（0.2 mg/0.2 mL），其余時間每天予以熏香煙2次（2次間隔時間6 h以上），每次8支，每次1 h，共6周；第15天開始于煙熏前1 h予以生理鹽水2 mL灌胃。A組：造模方法同模型組，于15 d起每天熏煙前1 h予以阿奇霉素灌胃（50 mg/kg），給藥4周。C組：正常飼養(yǎng)，第15天開始予以等量生理鹽水灌胃。各組大鼠飼養(yǎng)條件均相同。

1.2.2 體重記錄 每周日清晨稱量大鼠空腹時體重，稱量2次，求平均值并記錄。

1.2.3 標本處理 6周后處死所有大鼠，經心臟取血后立即以2 500 r/min離心15 min，分離血清，-80℃保存。取新鮮右肺中葉組織4%多聚甲醛固定后制作病理標本，蘇木精?伊紅（HE）染色觀察肺組織病理改變和氣道重塑指標：200倍鏡下，每個標本選取3個視野進行觀察，選擇直徑在 300～700 μm 的氣道，利用 Image?pro?plus 6.0圖像分析軟件測量支氣管的管壁面積、氣管總面積、管壁厚度和氣管外徑長度，然后計算管壁面積和氣管總面積比值（MA%）、管壁厚度與氣管外徑長度比值（MT%）。Masson染色觀察氣道壁膠原沉積情況。

1.2.4 酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測血清OPN水平 采用雙抗體夾心ELISA法，按照操作說明書將標準品稀釋成以下濃度：100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125、1.563、0.000 ng/mL，設置空白孔、標準孔、待測樣品孔，各組樣品設2個復孔，空白孔加樣品稀釋液100μL為調零孔，其余孔分別加入標準品或待測樣品100μL，37℃反應90 min，每個孔中加入生物素化抗大鼠OPN抗體100μL，37℃反應1 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，每孔加酶結合物工作液100μL，37℃溫育30 min，洗滌5次，每孔加入90μLTMB顯色液，37℃避光孵育15 min，最后加終止液50μL，此時溶液為黃色，在酶標儀450 nm波長處測量各孔的光密度（OD）值。

1.2.5 免疫組織化學法檢測OPN表達情況 按試劑盒說明書將OPN一抗稀釋為1：150，陰性對照組用PBS替代一抗，具體步驟為：石蠟切片脫蠟至水后，置于EDTA緩沖液中抗原修復，3%過氧化氫溶液阻斷內源性過氧化物酶，5%BSA封閉，滴加OPN一抗，4℃過夜，加入二抗、DAB溶液，顯微鏡控制顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水干燥、二甲苯透明、中性樹膠封固，最后光鏡下觀察，每張切片選擇3個視野。采用平均陽性染色面積百分比法分析免疫組織化學切片結果。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，方差齊數據采用單因素方差分析，多組間兩兩間比較采用SNK?q檢驗。兩變量間采用Pearson法分析相關性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠一般情況及體重變化 實驗前2周各組大鼠精神狀態(tài)、進食量、毛發(fā)色澤、對外界刺激反應均無明顯變化。隨后M、A組大鼠逐漸出現間斷咳嗽、呼吸急促、進食量減少、活動量減少、精神萎靡、毛發(fā)枯黃、脫落，但A組上述改變較M組輕。實驗開始時，三組大鼠體重比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；6周后，M組大鼠體重增加值[（91.67±24.47）g]比C組大鼠體重增加值[（168.17±31.10）g]、A組大鼠體重增加值[（127.50±3.33）g]均低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠肺組織病理改變 C組大鼠氣道結構正常，周圍無炎癥細胞浸潤，M組大鼠氣道平滑肌增生，黏液腺體增生，氣道內管黏液栓形成，氣道周圍膠原沉積增多，管壁增厚，管腔狹窄，氣道纖毛倒伏、脫落，周圍可見大量炎癥細胞浸潤；肺泡腔不規(guī)則擴張，肺泡間隔斷裂，肺大泡形成；A組上述改變較M組輕。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理改變

2.3 各組大鼠氣道重塑指標比較 M、A組氣道重塑指標MT%、MA%較C組明顯升高，但A組MT%、MA%低于M組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠氣道重塑指標比較（±s）

表1 各組大鼠氣道重塑指標比較（±s）

注：與 C 組比較，aP＜0.05；與 M 組比較，bP＜0.05

組別C組M組A組n6 6 6 MT%21.21±1.26 38.53±0.74a 28.15±1.32ab MA%13.87±0.38 29.06±1.31a 20.41±0.78ab

2.4 各組大鼠血清OPN水平比較 M組大鼠血清OPN水平[（44.63±2.01）ng/mL]較C組[（18.49±1.74）ng/mL]升高，A組血清OPN水平[（30.16±2.12）ng/mL]較M組降低，但較C組高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.5 各組大鼠肺組織OPN蛋白表達比較 OPN蛋白主要表達于支氣管上皮細胞，以及氣道及肺血管周圍的炎癥細胞，以細胞質著色為主，陽性產物為棕黃色沉淀，見圖2。C、M、A三組的OPN平均陽性染色面積百分比分別為（27.41±1.34）%、（60.33±2.33）%、（41.45±3.17）%，M 組OPN蛋白表達明顯高于C組，A組OPN蛋白表達明顯低于M組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖2 各組大鼠肺組織OPN蛋白的表達情況（免疫組織化學法，200×）

2.6 血清OPN水平、肺組織OPN蛋白表達與氣道重塑的相關性分析 血清OPN水平、肺組織OPN蛋白表達與氣道重塑指標 MA%[相關系數（r）＝0.967、0.980，P＜0.01]、MT%（r＝0.984、0.981，P＜0.01）均呈正相關，見圖 3。

圖3 血清OPN水平、肺組織OPN蛋白表達與氣道重塑的相關性分析

3 討 論

氣道重塑主要發(fā)生于直徑小于2 mm的小支氣管和細支氣管，是COPD患者發(fā)生不可逆氣流受限的病理基礎。本實驗發(fā)現，M、A組大鼠均出現了氣道重塑，氣道重塑發(fā)病機制十分復雜，目前認為氣道重塑主要涉及炎癥和非炎癥機制。研究發(fā)現，COPD患者氣道內和管壁均存在大量巨噬細胞、中性粒細胞、CD8+T淋巴細胞等炎細胞浸潤，且氣流受限程度與炎癥細胞浸潤程度呈正相關。炎癥細胞可通過釋放多種炎性介質、細胞因子、酶、活性氧等使局部組織損傷，介導組織異常修復，最終導致氣道重塑[2]。近年來，非炎癥機制也在COPD氣道重塑中起著重要作用，基質金屬蛋白酶（MMPs）?基質金屬蛋白酶抑制劑失衡、α1?抗胰蛋白酶水平異常、氧化應激反應及一些細胞因子的異常表達，如轉化生長因子?β1（TGF?β1）、血管內皮生長因子、成纖維細胞生長因子?2、表皮生長因子等均能促進氣道重塑[5?6]。本實驗發(fā)現，M組大鼠氣道重塑最顯著，其血清OPN水平、肺組織OPN蛋白表達均高于C、A組，且大鼠氣道重塑指標與血清OPN水平、肺組織OPN蛋白表達呈正相關，證明OPN可能是介導氣道重塑的因素之一。近年來研究表明，COPD患者體內的OPN水平與疾病嚴重程度呈正相關[7]。OPN主要表達于支氣管上皮細胞、內皮細胞、肺泡巨噬細胞、成纖維細胞和平滑肌細胞等，正常情況下，組織OPN表達很少，僅發(fā)揮生理功能，但低氧、炎癥、損傷等刺激均可誘導OPN表達增加。OPN作為一種炎癥趨化因子可促進中性粒細胞增殖和分化[8]，而中性粒細胞可通過釋放中性粒細胞彈性蛋白酶降解膠原和彈性纖維組織，引起肺泡及氣道結構破壞，中性粒細胞彈性蛋白酶還可誘導TGF?β的釋放，促進細胞外基質成分如纖黏蛋白、蛋白多糖、膠原的合成，引起細胞外基質沉積，從而造成氣道管壁變厚、管腔狹窄。OPN還能調節(jié)肺巨噬細胞的增殖、遷移、聚集，巨噬細胞可通過釋放MMPs，造成蛋白酶/抗蛋白酶失衡，降解細胞外基質，使肺組織彈性纖維斷裂，造成肺泡和氣道結構破壞，此外，細胞外基質降解后，更有利于炎癥細胞在肺組織聚集、遷移，進一步加重肺組織損傷。研究發(fā)現，OPN基因敲除裸鼠白細胞介素?12（IL?12）分泌較野生鼠明顯減少，氣道中炎性細胞及黏液分泌也減少，若給OPN基因敲除鼠注入重組OPN后則出現上述相反的情況，證實OPN可通過調節(jié)IL?12的分泌介導氣道炎癥及黏液分泌[9]。另外，OPN自身還可激活轉錄因子核因子κB和AP?1，從而潛在地調節(jié)多種炎性基因的表達[10]。

阿奇霉素是15元環(huán)半合成大環(huán)內酯類抗生素，以往研究表明，大環(huán)內酯類抗生素被有效用于治療慢性氣道炎癥性疾病，如彌漫性泛細支氣管炎，囊性纖維化、哮喘、支氣管擴張等[11?12]。近年來，阿奇霉素在 COPD中的療效也得到廣泛肯定。韓利等[13]研究表明，對于Ⅲ、Ⅳ級COPD穩(wěn)定期患者，長期小劑量阿奇霉素聯合布地奈德/福莫特羅較單一予以布地奈德/福莫特羅更能明顯改善患者肺功能，顯著改善相關臨床癥狀，并降低急性加重次數。既往對于阿奇霉素治療COPD的研究多集中于改善氣道炎癥、氣道黏液分泌等方面的研究，而對于治療COPD氣道重塑研究較少。本實驗發(fā)現，與M組比較，A大鼠氣道平滑肌和黏液腺體增生減少，氣道周圍炎細胞浸潤減少，氣道周圍膠原沉積減少，氣道重塑指標降低，且血清OPN水平、肺組織OPN蛋白表達水平明顯低于M組，證實阿奇霉素可減輕COPD氣道重塑，其機制可能與抑制OPN的表達有關。本實驗進一步探討了COPD氣道重塑的發(fā)病機制，為臨床應用阿奇霉素治療COPD提供了新的理論依據。

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