瑤藥小鉆中戈米辛R的含量測定*

唐炳蘭，孫國雄，莫單丹，程 婭，覃 朗△（.廣西藥用植物研究所/廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點實驗室，廣西南寧500；.廣西藥物不良反應(yīng)監(jiān)測中心，廣西南寧5005；.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部，廣西南寧500）

瑤藥小鉆來源系五味子科南五味子屬植物長梗南五味子（Kadsura longipedunculata Finet etGagnep）的根和莖，為瑤藥經(jīng)典“老班藥”中“十八鉆”之一，用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷、骨折、胃痛腹痛等[1]。小鉆的化學(xué)成分主要是木脂素和三萜類化合物，其中木脂素及其衍生物是小鉆中最主要成分[2?3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，小鉆主要有抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[4]、抗炎鎮(zhèn)痛[5]、抗腫瘤[6]、抗 HBV[7]、抗 HIV[8]等活性。作者前期對小鉆的化學(xué)成分做了系統(tǒng)的研究，從中分離得到的木脂素類化合物戈米辛R的含量比較大，可做為其特征成分之一。目前，鮮有關(guān)于高效液相色譜法（HPLC）測定小鉆含量的報道，為了更好地控制本品質(zhì)量，本研究采用反相高效液相色譜梯度洗脫法對小鉆中戈米辛R含量進(jìn)行測定，為正確評價瑤藥小鉆藥材的質(zhì)量優(yōu)劣，確保臨床用藥安全有效提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 安捷倫1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），KQ?5200型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），F(xiàn)A2004電子分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器公司），101?1型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海滬南科學(xué)儀器聯(lián)營廠），W201型恒溫水浴鍋（上海申生科技有限公司）。

1.1.2 試藥 戈米辛R對照品（自制，經(jīng)核磁共振譜、HPLC測定，純度大于98%）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純；水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件[9]色譜柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250.0 mm，5.0μm）；流動相：甲醇?0.4% 磷酸（含 0.2%三乙胺）水進(jìn)行梯度洗脫（甲醇在0～25 min由60%提高到90%，26～30 min由90%降低到60%）；檢測波長：254 nm，柱溫：30℃，流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：5μL。

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱定戈米辛R對照品9.52 mg于25 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，制成濃度為0.380 8 mg/mL的對照品溶液，即得。

1.2.3 供試品溶液的制備 取2 g小鉆粉末（精確至0.1 mg）于125 mL廣口瓶中，加入40 mL甲醇，超聲提取90 min，濾過，將濾紙上殘渣和濾渣混合后加入40 mL甲醇，繼續(xù)超聲提取90 min，合并2次濾液蒸干。殘渣用甲醇溶解，定容于10 mL容量瓶，搖勻，用0.45μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

1.2.4 陰性溶液的制備 以甲醇溶液作為陰性對照溶液。

1.2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 分別取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各5μL分別進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。

1.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對照品溶液1、3、5、7、9、11μL 進(jìn)樣，按上述色譜條件測定。以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析。

1.2.7 精密度試驗 取同一份戈米辛R對照品溶液，精密吸取5μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件測定峰面積，計算戈米辛R對照品相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h各進(jìn)樣5μL進(jìn)行測定，計算戈米辛R峰面積RSD。

1.2.9 重復(fù)性試驗[10]取小鉆藥材粉末約2 g，精密稱定，按“1.2.3”項方法制備6份供試品溶液，精密吸取5μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測定峰面積，計算樣品溶液中戈米辛R含量的RSD。

1.2.10 加樣回收率試驗[11?12]取已測含量的小鉆藥材粉末約1 g，精密稱定，共9份，分別精密加入80%、100%、120%的戈米辛R對照品（0.375 1 mg/mL）各3份，按“1.2.3”項方法制備成供試品溶液。分別精密吸取5μL進(jìn)樣測定峰面積，計算戈米辛R回收率。

1.2.11 樣品測定 采用上述方法分別對3批小鉆藥材的戈米辛R含量進(jìn)行測定，記錄色譜圖，外標(biāo)法計算含量。

2 結(jié) 果

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 在選定色譜條件下，供試品溶液在戈米辛R對照品相同保留時間處有一色譜峰，戈米辛R色譜峰與相鄰的色譜峰分離度大于1.5，已達(dá)到基線分離，理論塔板數(shù)按戈米辛R峰計算不低于5 000。陰性對照溶液無此吸收峰。說明本方法測定戈米辛R含量專屬性強(qiáng)，結(jié)果見圖1。

圖1 小鉆高效液相色譜圖

2.2 線性關(guān)系考察 戈米辛R的回歸方程：Y=1 720.90X+6.28，r=0.999 9。表明戈米辛 R進(jìn)樣量在0.380 8μg～4.188 8μg時，進(jìn)樣量與峰面積之間有良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗RSD=0.05%（n=6），表明該方法精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗RSD=0.21%（n=6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性試驗 戈米辛R平均含量為1.873 9 mg/g，RSD=1.31%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗 戈米辛R平均回收率為97.19%，RSD=1.66%。結(jié)果見表1。

表1 戈米辛R加樣回收率測定結(jié)果

2.7 樣品測定 3批藥材戈米辛R含量分別為1.881 2、1.951 3、2.100 4 mg/g，RSD分別為1.37%、1.35%、0.96%。

3 討 論

3.1 指標(biāo)成分選擇 本實驗選擇木脂素類化合物戈米辛R為小鉆質(zhì)量控制指標(biāo)是因為戈米辛R在小鉆中含量較高，對控制該藥材質(zhì)量有重要意義。

3.2 供試品溶液制備方法的優(yōu)化 本實驗對樣品超聲處理和加熱回流2種提取方法進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示：超聲提取的效率優(yōu)于回流提取，提取時間考察了15、30、60、90、120 min，結(jié)果顯示：90 min 的提取效率最高。故選擇超聲提取90 min。料液比分別考察了2∶20、2∶40、2∶50、2∶60、2∶70、2∶80，結(jié)果表明：料液比為 2∶40時提取率最高，故選擇加入甲醇40 mL。提取次數(shù)分別考察了提取1、2、3次，結(jié)果顯示，提取2次小鉆中戈米辛R成分基本能提取完全。綜上所述，采用超聲提法，提取時間為90 min，甲醇加入量為40 mL，提取2次，小鉆中戈米辛R成分的提取率高，干擾峰減少，重復(fù)性良好。

3.3 流動相的優(yōu)化 在選擇流動相過程中，本實驗曾采取甲醇?磷酸水、乙腈?磷酸水等度系統(tǒng)，但分離效果均不理想，經(jīng)反復(fù)實驗后，發(fā)現(xiàn)以甲醇和磷酸（含三乙胺）水梯度洗脫時，能使戈米辛R和相鄰物質(zhì)達(dá)到較好的分離，峰形較好。檢測波長選擇方面，對戈米辛R在200～400 nm間進(jìn)行紫外掃描，確定最大吸收波長，結(jié)果在254 nm時戈米辛R有最大吸收，故選擇檢測波長為254nm。

綜上所述，反相高效液相色譜法簡便，測定瑤藥小鉆中戈米辛R含量結(jié)果準(zhǔn)確、可信，可有效控制小鉆藥材質(zhì)量。

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