一貫煎對(duì)子癇前期大鼠胎盤NF-κB mRNA與MMP-9 mRNA表達(dá)影響*

黎 燕 ，曹保利 ，劉 筠

子癇前期是妊娠期有著特殊臨床特征的多系統(tǒng)疾病,在世界范圍內(nèi)影響著2%～8%的妊娠,是孕產(chǎn)婦發(fā)病和死亡的主要原因[1－2]，尤其是在低收入和中等收入的國(guó)家[3－4]。其發(fā)病病機(jī)和病因尚未完全明確,胎盤淺著床理論被廣泛接受，基質(zhì)金屬蛋白酶－9（MMP－9）作為基質(zhì)金屬蛋白酶的重要成員，在滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤(rùn)過程中發(fā)揮著核心作用，核轉(zhuǎn)錄因子（NF－κB）是多種重要前炎性因子的轉(zhuǎn)錄激活因子，通過對(duì)表達(dá)過程中最重要的環(huán)節(jié)即轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)來(lái)發(fā)揮其重要功能。一貫煎為中醫(yī)經(jīng)典滋陰名方,臨床上對(duì)妊娠期高血壓疾病有治療作用，本研究通過一氧化氮合成酶抑制劑亞硝基左旋精氨酸甲酯（L－NAME）建立子癇前期大鼠模型，用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法檢測(cè)各組大鼠胎盤NF－κB mRNA和MMP－9 mRNA的表達(dá)，探究一貫煎對(duì)子癇前期大鼠胎盤NF－κB mRNA和MMP－9 mRNA表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 分組及建立模型 將符合要求的孕鼠納入實(shí)驗(yàn)，妊娠第10天測(cè)量孕鼠血壓并測(cè)24 h尿蛋白。妊娠第12天將孕鼠隨機(jī)分為兩組：正常妊娠組10只，子癇前期模型組26只，子癇前期模型組于妊娠13 d至妊娠第19天皮下注射L－NAME 50 mg/（kg·d）建立大鼠子癇前期模型，正常妊娠組則注射等量生理鹽水。妊娠第15天再次測(cè)量各組孕鼠血壓及24 h尿蛋白，將子癇前期模型組符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的23只孕鼠隨機(jī)抽取20只納入實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行第2次分組，隨機(jī)分為模型對(duì)照組10只，一貫煎治療組10只，從妊娠16 d開始，C組加用一貫煎顆粒，B組加注同等劑量的生理鹽水，灌胃給藥，直至妊娠19 d。

1.2 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè) 妊娠第10天、妊娠第15天、妊娠第19天測(cè)量各組孕鼠血壓并收集24 h尿，送本院實(shí)驗(yàn)室測(cè)量24 h尿蛋白。

1.3 標(biāo)本采集與處理 各組大鼠妊娠第20天收集24 h尿后，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，取出胎鼠和胎盤，選取胎盤組織生理鹽水漂洗后保存于－70℃?zhèn)溆谩Ｒ訰T－PCR法檢測(cè)各組孕鼠胎盤組織NF－κB mRNA及MMP－9 mRNA的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胎盤中NF－κBmRNA表達(dá)比較 與正常妊娠組比較，模型對(duì)照組、一貫煎治療組NF-κB mRNA表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），一貫煎治療組較模型對(duì)照組相比，NF-κB mRNA表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 各組大鼠胎盤中NF-κB mRNA表達(dá)的比較（x±s）Fig.1 Comparison of the expression of NF-κB mRNA in placenta of rats in each group（x±s）

2.2 各組大鼠胎盤中MMP-9 mRNA表達(dá)比較 與正常妊娠組比較，模型對(duì)照組、一貫煎治療組MMP-9 mRNA表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），一貫煎治療組較模型對(duì)照組相比，MMP-9 mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 各組大鼠胎盤中MMP-9 mRNA表達(dá)的比較（x±s）Fig.2 Comparison of the expression of MMP-9 mRNA in placenta of rats in each group（x±s）

3 討論

目前妊娠期高血壓疾病的發(fā)病病機(jī)和病因尚未完全明確,子宮淺著床被眾多學(xué)者所認(rèn)可，妊娠期高血壓疾病患者的滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力減弱,造成妊娠期胎盤床的血管重鑄發(fā)生障礙,胎盤植入過淺，導(dǎo)致胎盤缺血缺氧，最終出現(xiàn)臨床癥狀。免疫失調(diào)或免疫不匹配可能與妊娠期高血壓疾病的發(fā)生有著重要聯(lián)系。滋養(yǎng)細(xì)胞的整個(gè)浸潤(rùn)過程包括黏附、基質(zhì)的溶解、和細(xì)胞的遷移，在此過程中的重要環(huán)節(jié)為溶解基質(zhì)，它為滋養(yǎng)細(xì)胞的侵蝕掃除了物理屏障，但是滋養(yǎng)細(xì)胞本身不能吞噬和溶解基質(zhì)，只能分泌作用于細(xì)胞外間質(zhì)的酶：基質(zhì)金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶/半胱氨酸蛋白酶蛋白酶等，其中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一組降解細(xì)胞外基質(zhì)、結(jié)締組織蛋白的蛋白酶家族[5-6]，是降解蛻膜基質(zhì)的重要酶類，幾乎能降解全部的基質(zhì)成分，在胚胎的植入、胎盤的形成、和子宮螺旋動(dòng)脈重鑄等過程中發(fā)揮著重要的作用。MMP-9屬膠原酶類[8]，目前被證明為最有效的蛋白水解酶，其分泌量直接關(guān)系到胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力和血管的重鑄，純化的抗MMP-9抗體可以阻斷滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的浸潤(rùn)，表明MMP-9在滋養(yǎng)層細(xì)胞植入中起重要作用[7]，MMP-9的表達(dá)不足,導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)子宮螺旋動(dòng)脈的侵襲不足，胎盤淺植入，造成胎盤血血流灌注不足，胎盤缺血，進(jìn)而損傷母體血管系統(tǒng)，最終引發(fā)臨床癥狀。

NF－κB蛋白家族，是最近幾年來(lái)最有研究潛力的調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。正常情況下，它以非活性形式存在于胞漿中，由P50/P65和IkB組成[8]。在胞外刺激下，NF-κB三聚體復(fù)合物中的IkB發(fā)生磷酸化而解離，而NF-κB二聚體由胞漿移位至胞核，并與NF-κB反應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)域的kB位點(diǎn)相結(jié)合，從而啟動(dòng)這些基因的轉(zhuǎn)錄，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞因子、黏附分子、趨化因子等的調(diào)控，相關(guān)研究提示，NF-κB存在于人類滋養(yǎng)細(xì)胞中[10]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)妊高征孕婦血漿中升高的過氧化物可以使培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB活化提高，并顯著上調(diào)細(xì)胞表面細(xì)胞間粘附分子-1的表達(dá)，提示NF-κB有可能在妊娠期高血壓疾病中的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[11]。妊娠期由于胎盤低氧，激活NF-κB，一方面使滋養(yǎng)細(xì)胞增殖與凋亡的失調(diào)，從而使滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤(rùn)能力減弱；另一方面在滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤(rùn)活性形成的過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞激活與損傷，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生異常，釋放的毒性因子使血管變得狹窄，不利于胎盤血管重鑄。同時(shí)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡時(shí)產(chǎn)生的一些細(xì)胞因子，使人核因子κB抑制蛋白（IκB）發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞因子的表達(dá)，使血管壁平滑肌細(xì)胞增生，促使血管壁增厚，血管痙攣，降低胎盤的血流灌注量，使胎盤缺血、缺氧，最終導(dǎo)致全身血壓增高。

NF-κB與MMP-9共同參與了滋養(yǎng)細(xì)胞侵蝕和胎盤血管重鑄，在妊娠中的意義重大，它們表達(dá)的異?？蓪?dǎo)致子癇前期的發(fā)生。研究結(jié)果子癇前期大鼠的胎盤NF-κB mRNA表達(dá)較正常妊娠組明顯升高，MMP-9 mRNA則明顯降低，經(jīng)一貫煎治療后，NF-κ BmRNA較子癇前期組明顯降低，MMP-9 mRNA明顯升高。結(jié)果表明一貫煎以下調(diào)NF-κB，上調(diào)MMP-9的表達(dá)來(lái)治療子癇前期，為臨床治療子癇前期提供了新的思路。

在中醫(yī)學(xué)中，子癇前期屬“子腫”“子暈”“子癇”范疇[12]，陰虛陽(yáng)亢、上擾清竅是其主要病機(jī)，臨床上該病患者以肝腎陰虛者多見，多表現(xiàn)為肝陰不足的諸多癥狀，治療多以滋陰為主，方選一貫煎加減。一貫煎為中醫(yī)經(jīng)典名方，由名醫(yī)魏之琇所創(chuàng)，此方由北沙參、麥門冬、生地、當(dāng)歸、枸杞、川楝子組成，具有滋陰疏肝的功效，可用于治療肝陰虧虛所致的多種疾病。一貫煎組方嚴(yán)謹(jǐn)、配伍精當(dāng)，方中重用生地滋陰壯水，配伍枸杞子補(bǔ)肝血、養(yǎng)肝體以和肝用；再入甘寒質(zhì)潤(rùn)之麥冬、沙參補(bǔ)養(yǎng)肝胃之陰,使肺胃津旺，金氣清肅下行,自能制木;更入少量川楝子,性寒不燥,既能疏泄肝氣,又能順肝木條達(dá)之性,且制諸藥滋膩礙胃之弊[13]。有研究報(bào)道一貫煎加減對(duì)高血壓及妊娠期高血壓疾病療效顯著[14-15]。

本研究結(jié)果顯示：子癇前期大鼠的胎盤NF－κB mRNA表達(dá)較正常妊娠組明顯升高，MMP－9 mRNA則明顯降低，經(jīng)一貫煎治療后，NF－κB mRNA較子癇前期組明顯降低，MMP－9 mRNA明顯升高。這表明：一貫煎以下調(diào)NF－κB，上調(diào)MMP－9的表達(dá)來(lái)治療子癇前期，為臨床治療子癇前期提供了新的思路。

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