血府逐瘀膠囊對流產(chǎn)大鼠血瘀型產(chǎn)后惡露不絕治療作用研究*

王 梓 ，王 帆 ，楊欣瑩 ，康 利 ，王 蕾

產(chǎn)后惡露不絕指的是產(chǎn)后持續(xù)3周以上出現(xiàn)陰道不規(guī)則出血，伴血塊或壞死蛻膜組織成分血液物質(zhì)，中醫(yī)認(rèn)為，產(chǎn)后惡露不絕多因產(chǎn)后沖任不調(diào)，氣血不足，氣血運行不暢有關(guān)，導(dǎo)致瘀血內(nèi)滯、新血不得歸經(jīng)[1－2]。血府逐瘀湯臨床上可用于治療血瘀等瘀癥的治療，本實驗通過復(fù)制大鼠流產(chǎn)模型，觀察血府逐瘀膠囊對流產(chǎn)大鼠血流變、血紅蛋白、血小板聚集功能的影響，進一步探討血府逐瘀膠囊對血瘀型產(chǎn)后惡露不絕的治療作用和機制。

1 材料

1.1 實驗藥物及試劑 血府逐瘀膠囊藥粉由天津宏仁堂藥業(yè)有限公司提供，磚紅色粉末，每袋2.5 kg，批號E03023。益母草膏：棕黑色膏狀半流體，廣西維威制藥有限公司生產(chǎn)，批號160304。米非司酮片：每片25 mg，華潤紫竹藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：43160201。米索前列醇片：每片0.2 mg，華潤紫竹藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：43160315。膠原誘導(dǎo)劑：1 mL，HELENA，LOT4－16－5368,EXP11－17。ADP 誘導(dǎo)劑：1 mL，HELENA，LOT7－16－5366，EXP6－17。CD34抗體：0.1 mL，武漢博士德，批號10CM130。

1.2 實驗動物 SD大鼠，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。許可證號：SCXK（京）2012－0001。雄性 30只（體質(zhì)量 300～320 g），雌性 70只（體質(zhì)量200～220 g）。動物飼養(yǎng)在具有實驗動物使用許可證[許可證號：SYXK（津）2011－0003]的實驗環(huán)境內(nèi)，每日供給北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)的普通鼠全價顆粒飼料，產(chǎn)品許可證號：SCXK（京）2014－0010。

1.3 實驗儀器 全自動血球計數(shù)器，MEK－6318K，日本光電；血小板聚集儀，AggRAM，海倫娜；血流變儀，LG－R－80（A 型），北京世帝科學(xué)儀器有限公司；ASP200S自動真空組織脫水機；Leica EG1150H自動生物組織包埋切片機；HMIAS－2000高清晰度數(shù)碼顯微圖像分析系統(tǒng)。

2 方法

2.1 造模方法 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，合籠當(dāng)日的白天，雌鼠與雄鼠臨籠擺放，當(dāng)日下午5時將雌鼠與雄鼠以2∶1合籠，次日早晨進行陰道栓和陰道涂片檢查，以發(fā)現(xiàn)陰道栓或者大鼠精子當(dāng)天為受孕第1天，連續(xù)4 d，剔除4 d后未檢出陰道栓或大鼠精子的雌性大鼠，選取10只受孕大鼠作為正常對照組，其他受孕大鼠于受孕第7天分別灌胃米非司酮（8.3 mg/kg，上午 8:00）和米索前列醇（0.1 mg/kg，下午5:00），灌胃體積10 mL/kg。給藥第1天灌胃米索前列醇后，陰道內(nèi)置干棉球1個，第2天以陰道有流血判斷流產(chǎn)模型的復(fù)制成功。給藥同時給予流產(chǎn)大鼠冷水浴，并適當(dāng)斷食，制備早孕流產(chǎn)血瘀大鼠模型[3-5]。

2.2 動物分組 將未流產(chǎn)大鼠作為正常對照組，將流產(chǎn)雌性大鼠按體質(zhì)量隨機分為5組（模型對照組、血府逐瘀高、中、低劑量組、陽性藥對照組），每組10只，隨機編號，用苦味酸在大鼠不同部位做標(biāo)記進行區(qū)分。

2.3 給藥方法 各組大鼠于受孕第8天開始按相應(yīng)劑量灌胃給藥，灌胃相應(yīng)受試藥液10 mL/kg，1 次/日，各劑量分別為 1.92、0.96、0.48 g 藥粉/kg（分別相當(dāng)于臨床人用劑量24、12、6倍）。正常對照組、模型對照組灌胃等體積溶媒介質(zhì)純凈水、陽性藥對照組灌胃益母草膏3 mL/kg，相當(dāng)于臨床人用劑量12倍。連續(xù)給藥7 d。

2.4 觀察指標(biāo) 造模期間觀察大鼠生活狀態(tài)，末次給藥后1 h，腹腔注射4.5%戊巴比妥（1 mL/kg）麻醉，腹主動脈取血，部分以肝素1∶9抗凝，用于檢測血流變指標(biāo)；部分以3.8%枸櫞酸1∶9抗凝，用于檢測血小板聚集率[6-7]，另取10 μL用于血球計數(shù)檢測。解剖子宮，并置于12%中性福爾馬林中固定，HE染色及免疫組化法檢測CD34抗原。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血府逐瘀膠囊對產(chǎn)后血瘀大鼠存活狀態(tài)的影響 與正常對照組相比，模型組對照組大鼠發(fā)生較大變化，主要表現(xiàn)為少動、精神不振、炸毛、體態(tài)偏瘦、部分有稀便。血府逐瘀高、中劑量組及陽性藥組較模型組相比，大鼠生存狀態(tài)有較大改善，趨近于正常組，低劑量組改善不明顯。

3.2 血府逐瘀膠囊對產(chǎn)后血瘀大鼠血流變學(xué)及血小板聚集功能的影響 模型對照組大鼠與正常對照組相比，全血黏度、血漿黏度顯著增加（P<0.05，P<0.01）。與模型對照組相比，血府逐瘀膠囊高、中劑量組可明顯降低全血高切、低切、血漿黏度（P<0.05，P<0.01），從而改善大鼠血液黏濃凝滯的狀態(tài)。在以ADP及膠原為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下，模型對照組大鼠與正常對照組相比，血小板聚集率明顯增大（P<0.01），說明模型對照組大鼠血液處于血小板功能亢進及高凝血因子狀態(tài)。與模型對照組相比，血府逐瘀膠囊高、中劑量組可以不同程度的降低血小板聚集，尤以高劑量組為佳。見表1及圖1、2。

表1 血府逐瘀膠囊對產(chǎn)后血瘀大鼠血流變學(xué)及血小板聚集功能的影響（x±s）Tab.1 Effects of Xuefu Zhuyu capsules on blood rheology and platelet aggregation function in abortion rats（x±s）

圖1 以ADP為誘導(dǎo)劑的大鼠血小板聚集圖Fig.1 Platelet aggregation of rats induced by ADP

圖2 以膠原為誘導(dǎo)劑的大鼠血小板聚集圖Fig.2 Platelet aggregation of rats induced by collagen

3.3 血府逐瘀膠囊對產(chǎn)后血瘀大鼠RBC及HGB含量的影響 與正常對照組相比，模型對照組紅細(xì)胞及血紅蛋白含量顯著降低（P<0.05，P<0.01）。血府逐瘀膠囊高中劑量組可以顯著增加模型大鼠RBC及 HGB 含量（P<0.05，P<0.01），能一定程度上改善產(chǎn)后血瘀大鼠血虛的狀況。見表2。

表2 血府逐瘀膠囊對產(chǎn)后血瘀大鼠血液中RBC及HGB含量的影響（x±s）Tab.2 Effects of Xuefu Zhuyu capsules on the contents of RBC and HGB in abortion rats（x±s）

3.4 血府逐瘀膠囊對產(chǎn)后血瘀大鼠子宮MVD的影響 MVD是評估血管生成的指標(biāo)之一，CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性高，在組織有血瘀的情況，經(jīng)活血化瘀治療后新生血管改善微循環(huán)，HE染色結(jié)合免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記CD34結(jié)果顯示空白對照組子宮內(nèi)膜組織排列好。與空白對照組相比，模型組子宮內(nèi)膜和內(nèi)膜下血管數(shù)量明顯減少。與模型對照組相比，高、中、低及陽性組有不同程度改善，血管數(shù)量有所增加，以陽性組和中劑量組較為明顯。見圖3。

4 討論

產(chǎn)后惡露一詞源自漢代《金匱要略·婦人產(chǎn)后病脈證治》中“產(chǎn)后七八日，無太陽證，少腹堅痛，此惡露不盡”，提出了產(chǎn)后惡露不盡與產(chǎn)后瘀血內(nèi)阻兼陽明腑實的證治觀點[8]中醫(yī)認(rèn)為，產(chǎn)后惡露不絕發(fā)生的機制為沖任為病，氣血運行失常所致，其病因主要是氣虛、血瘀、血熱[9-11]。產(chǎn)后血室正開，寒邪內(nèi)侵胞宮與血相結(jié)，寒凝血瘀，或七情所傷，氣滯血瘀，或氣虛運血無力，余血滯留為瘀，或胞衣殘留，影響沖任，總之瘀血不去，新血不得歸經(jīng)而出現(xiàn)惡露不絕。

圖3 血府逐瘀膠囊對產(chǎn)后血瘀大鼠子宮MVD的影響Fig.3 The effects of Xuefu Zhuyu capsules on the uterus MVD of rats

血府逐瘀湯，中醫(yī)方劑，為理血劑，具有活血化瘀，行氣止痛之功效。該方是清代名醫(yī)王清任所創(chuàng)，主治血瘀證等，藥方始收于《醫(yī)林改錯·上卷》。全方由當(dāng)歸、生地等11味中藥組成[12]。本實驗通過復(fù)制的大鼠早孕流產(chǎn)模型，較大程度上模擬臨床上產(chǎn)后血瘀所致的惡露不絕等臨床癥狀。希望闡明血府逐瘀膠囊對產(chǎn)后惡露不絕的治療作用及機制。

模型大鼠經(jīng)過血府逐瘀膠囊治療后，經(jīng)血流變和血小板聚集功能檢查發(fā)現(xiàn)，血府逐瘀膠囊能較大程度改善流產(chǎn)大鼠血瘀等癥狀，降低模型組大鼠全血及血漿粘度，改善血液黏稠凝滯狀態(tài)，糾正凝血功能，降低血小板聚集率，增加大鼠血液中血紅蛋白和紅細(xì)胞含量，改善大鼠血虛癥狀。

CD34抗原是一種階段特異性白細(xì)胞分化抗原，分子量100-120KD，選擇性表達造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面。CD34是高度糖基化N型跨膜蛋白[13]，CD34在新生血管內(nèi)皮中表達遠遠大于非新生血管內(nèi)皮，提示高度表達應(yīng)該和新血管生成有密切的關(guān)系，故CD34為比較敏感的血管內(nèi)皮標(biāo)志物[14]。采用CD34抗原免疫組化法測量子宮微血管密度，能較為直接地反映出流產(chǎn)大鼠經(jīng)過治療后的子宮血管再生功能[15-16]，經(jīng)過血府逐瘀膠囊的治療，HE染色結(jié)合免疫組織化標(biāo)記CD34結(jié)果顯示血府逐瘀膠囊高劑量組大鼠與模型組相比，子宮膜組織排列較為整齊，子宮內(nèi)膜和內(nèi)膜下新生血管明顯增多，微循環(huán)得到一定程度上的改善。

通過本實驗研究，血府逐瘀膠囊具有除瘀血生新血的綜合療效，能改善血液濃、黏、滯的狀態(tài)，改善紅細(xì)胞變形能力，降低紅細(xì)胞聚性，抑制血小板聚集從而改變產(chǎn)后瘀血癥狀，促進血管新生，對產(chǎn)后血瘀、惡露不絕具有較好的治療作用。

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