虎源犬瘟熱病毒的分離鑒定及H基因的序列分析

單 芬吳其銳鄒潔建花福有陳 武*

(1.廣州動(dòng)物園，廣州，510070；2.廣東省野生動(dòng)物救護(hù)中心，廣州，510635；3.深圳野生動(dòng)物園，深圳，518055)

犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbillivirus)成員。感染的宿主范圍較廣，包括浣熊科(Procyonidae)、熊科(Ursidae)、靈貓科(Niverridae)、鬣狗科(Hyaenidae)、貓科(Felidae)及鼬科(Mustelidae)等動(dòng)物[1]。2014年12月陜西珍稀野生動(dòng)物救護(hù)中心4只大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)感染犬瘟熱死亡，開始對(duì)這個(gè)疫病的重視。

東北虎(Pantheratigrisaltaica)是我國(guó)Ⅰ級(jí)保護(hù)動(dòng)物，為瀕危物種，Tracie A等研究學(xué)者在2013年通過(guò)RT-PCR及免疫組化(IHC)等方法證實(shí)了2只出現(xiàn)典型神經(jīng)癥狀的野外東北虎死于CDV感染[2]，而國(guó)內(nèi)尚未見虎感染CDV的相關(guān)報(bào)道。隨著生態(tài)環(huán)境的變化和CDV對(duì)動(dòng)物流行病因素的適應(yīng)，加之CDV 變異株的出現(xiàn)，目前犬瘟熱呈現(xiàn)的發(fā)病率和致死率有所升高、感染動(dòng)物的宿主范圍有擴(kuò)大的趨勢(shì)。本研究從死亡東北虎身上采集病料組織通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)、RT-PCR等方法進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)H基因全序列進(jìn)行分子特征和遺傳演化分析，為野生動(dòng)物特別是瀕危貓科動(dòng)物CDV的有效防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本

病料樣本來(lái)自廣東某地感染CDV病死東北虎的組織。病患臨床癥狀表現(xiàn)為精神沉郁、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、抽搐等神經(jīng)癥狀，經(jīng)抗生素等治療無(wú)效而死亡。病料組織于研缽在冰上剪碎，加上PBS 充分研磨，待研磨完全后，8 000 r /min 高速離心25 min 后取上清液，用0.2 μm 濾膜過(guò)濾，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

ExTaqDNA 聚合酶、克隆載體pMD18-T、AMV Reverse Transcriptase、dNTPs、工程菌JM109等購(gòu)自大連寶生物工程公司；Trizol、RNase Inhibitor 購(gòu)自Invitrogen公司；膠回收試劑盒購(gòu)自天根生物科技有限公司；Vero細(xì)胞由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、新生胎牛血清購(gòu)自Hyclone 公司。

1.3 細(xì)胞復(fù)蘇及病毒培養(yǎng)

從-80 ℃取出凍存的Vero 細(xì)胞，置于37 ℃水浴鍋水浴5 min，800 r /min 離心3 min，棄去上清，加入含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基吹打混勻后，分裝在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱37 ℃靜置培養(yǎng)。待Vero 細(xì)胞長(zhǎng)至80% 后，棄去培養(yǎng)基，加入1 mL 制備好的病毒液接種細(xì)胞，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，37 ℃靜置培養(yǎng)2 h，待病毒吸附后，棄去病毒液。加維持液繼續(xù)放于細(xì)胞培養(yǎng)箱37 ℃靜置培養(yǎng)，盲傳3代后，再接種細(xì)胞，每日觀察細(xì)胞CPE，當(dāng)CPE達(dá)到80% 時(shí)收獲病毒液，分裝凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.4 基因克隆和測(cè)序

使用E.Z.N.A.Viral RNA Kit(OMEGA，美國(guó))進(jìn)行病毒RNA 的提取，參照SuperScript III(Invitrogen，美國(guó))操作說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用犬瘟熱病毒基因特異性引物，PCR擴(kuò)增CDV H基因保守片段，引物由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室提供，鑒定引物信息如下：上游 5′-ATAGATGTCTTGACACCGCTCTT-3′，下游 5′-GTACATACCTTGGCTTTGGAACT-3′，目的片段預(yù)計(jì)大小為580 bp。參考NCBI中犬瘟熱病毒H基因全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)H基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物，引物序列略。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后，與pMD18-T 載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，初步鑒定正確的重組質(zhì)粒由深圳華大基因公司測(cè)序。

1.5 序列分析

用Lasergene Version 7.1 軟件的SeqMan拼接所得的基因序列，測(cè)得序列登陸NCBI，與GenBank中不同犬瘟熱的H基因序列進(jìn)行BLAST分析。同時(shí)與下載不同基因型的犬瘟熱病毒序列采用MegAlign進(jìn)行不同序列、氨基酸比較分析。采用MEGA 5.1軟件繪制其H基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹的繪制方法如下：應(yīng)用Neighbor-joining 法(參數(shù)設(shè)置為1 000 replications)、最大似然法(ML 法)、貝葉斯法(BI 法)構(gòu)建的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹及Maximum composite likelihood model 比對(duì)核苷酸序列。采用NetNGlyc1.0軟件進(jìn)行糖基化位點(diǎn)分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒的細(xì)胞分離

病料經(jīng)過(guò)Vero細(xì)胞盲傳3代后再接種Vero細(xì)胞，到第3天時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)基中出現(xiàn)明顯的細(xì)胞脫落和死亡；第4天，出現(xiàn)明顯的塊狀細(xì)胞脫落，細(xì)胞CPE病變明顯。圖1、圖2所示為病料肺、腎組織接種Vero細(xì)胞傳代6次之后的細(xì)胞變化。

圖2 Vero細(xì)胞肺6代Fig.2 The sixth generation of Vero cells in lung

2.2 犬瘟熱H基因特異性鑒定引物的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

提取犬瘟熱病毒的RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增、1%的瓊脂糖凝膠電泳之后，結(jié)果得到大小約為580 bp的目的基因片段，結(jié)果與預(yù)期大小一致，其中泳道1、2、3、4分別為不同臟器組織樣本的擴(kuò)增結(jié)果(圖3)。

2.3 H基因的序列及遺傳演化分析

獲得的H基因序列經(jīng)DNASTAR Version 7.1 軟件包中的seqman 軟件拼接正確無(wú)誤后，命名為CDV-1，登陸NCBI，經(jīng)BLAST 分析，各基因與GenBank中核苷酸序列相似性最高的毒株列于表1。從表中可以看出分離株的H基因與1999年中國(guó)小熊貓(Ailurusfulgens)源分離株、2014年中國(guó)東北虎源的犬瘟熱病毒分離株的H蛋白核苷酸序列相似性最高，均為99%。

圖3 RT-PCR擴(kuò)增的H基因Fig.3 RT-PCR amplification of H geneM：DL 2 000 marker；1、2、3、4：H 基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；5：陰性對(duì)照；6：陽(yáng)性對(duì)照M：DL 2 000 marker；1、2、3、4：H gene；5：Negative control；6：Positive control

表1 分離株與GenBankTM中核苷酸序列相似性最高的毒株

Tab.1 Homology of the isolate H genes from siberian tiger with the related sequences in GenBankTM

登陸GenBank下載不同基因型的CDV代表毒株，采用MegAlign軟件進(jìn)行核苷酸序列及編碼氨基酸的比對(duì)分析。其中本分離株與標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株A15/17的氨基酸相似性為96.2%；而與經(jīng)典疫苗Onderstepoort株的氨基酸序列相似性僅為89.8%；與其他疫苗株SH、CDV3、Convac、lederle的氨基酸序列相似性分別為91.6%、91.6%、91.3%、91.8%；與其他Asia-1基因型的毒株相比氨基酸序列相似性在95.9%～97.5%之間。不同CDV分離株氨基酸序列相似性比對(duì)結(jié)果詳見圖4。

采用MEGA 5.1軟件繪制CDV H基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用3種方法構(gòu)建H基因進(jìn)化樹，3種方法的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)完全一致，結(jié)果見圖5。由圖5可知：本研究分離株CDV-1位于Asia-1，和目前我國(guó)犬瘟熱流行毒株流行情況一致。與疫苗株屬于的America-1(Vaccine strain)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在Asia-1基因分支內(nèi)，與另外一株?yáng)|北虎源分離株一起形成一個(gè)小的進(jìn)化分支。CDV分離株遺傳演化分析結(jié)果詳見圖5。

圖4 不同CDV分離株氨基酸序列相似性比對(duì)Fig.4 Similarity comparison of amino acid sequences between different CDV isolates

圖5 不同CDV毒株H基因遺傳演化分析Fig.5 The phylogenetic tree of CDV strains based on H gene sequence

CDV H蛋白作為重要的膜蛋白，主要通過(guò)與宿主體內(nèi)SLAM受體的結(jié)合從而可以復(fù)制。研究表明H蛋白個(gè)別氨基酸位點(diǎn)改變會(huì)影響與SLAM受體的結(jié)合能力。文獻(xiàn)報(bào)道這些位點(diǎn)集中在525、526、529、530、549等位點(diǎn)。分析發(fā)現(xiàn)本分離株的這幾個(gè)位點(diǎn)氨基酸與強(qiáng)毒株A75/17完全一致，與疫苗株相比530、549位氨基酸差異明顯。詳細(xì)情況見表2。

本研究毒株H蛋白氨基酸序列與其他Asia-1型毒株相比在V47、M50、N77、R110、F198、T245、S265、N277、V337、A365、S388、V522等位點(diǎn)發(fā)生變異。

大量研究表明，H蛋白的糖基化位點(diǎn)的個(gè)數(shù)和位置與病毒的復(fù)制能力有關(guān)。采用NetNGlyc1.0軟件進(jìn)行H蛋白糖基化位點(diǎn)分析，結(jié)果顯示：本研究的分離株具有9個(gè)糖基化位點(diǎn)，其中包括309-311位的野毒株特有的糖基化位點(diǎn)。而疫苗OP株僅有4個(gè)、其他幾個(gè)疫苗株均含有7個(gè)。本研究毒株在其他位點(diǎn)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)新增的糖基化位點(diǎn)，這和大量文獻(xiàn)中報(bào)道的流行毒株的情況相對(duì)一致，其他基因型的野毒株含有8個(gè)或9個(gè)糖基化位點(diǎn)。詳細(xì)情況見表3。

表2 不同毒株與SLAM受體結(jié)合位點(diǎn)分析

Tab.2 Analysis of binding sites of SLAM receptor in different strains

表3 不同毒株N-糖基化位點(diǎn)

Tab.3 Distribution status of N-glycosylation sites of H gene in different genetypes of CDV

注：N代表糖基化位點(diǎn)；— 代表無(wú)此糖基化位點(diǎn)

Note：N N-glycosylation sites；— Negative

3 討論

3.1 犬瘟熱(CDV)H蛋白的氨基酸變異

H蛋白作為犬瘟熱病毒表面膜蛋白，還協(xié)助病毒的另一囊膜糖蛋白F蛋白介導(dǎo)病毒囊膜與細(xì)胞膜發(fā)生膜融合，使病毒進(jìn)入細(xì)胞[3]。研究證明：CDV感染動(dòng)物，宿主體內(nèi)至少存在兩種受體，其中一種就是淋巴細(xì)胞信號(hào)活性分子(Signaling lymphocytic activation molecule，SLAM)，CDV利用此受體，首先在呼吸道淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中大量繁殖，進(jìn)而隨淋巴液和血液循環(huán)，侵染全身各免疫細(xì)胞[4]。大量實(shí)驗(yàn)研究證明CDV H蛋白個(gè)別氨基酸位點(diǎn)改變就會(huì)影響與SLAM受體的結(jié)合，從而使毒株在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)發(fā)生重要改變[5-7]。A75/17毒株被看作是犬瘟熱病毒典型的強(qiáng)毒株A75/17 H 蛋白的Y525、D526 和 R529 是其與 SLAM 受體結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。本研究毒株與其相比這3個(gè)位點(diǎn)的氨基酸完全一致。這次分離的毒株是否為強(qiáng)毒株，毒力研究還在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中。研究還表明野毒株的H蛋白530和549位點(diǎn)的改變也會(huì)出現(xiàn)與SLAM 受體結(jié)合的差異，本研究毒株549位氨基酸為Y，和A75/17等部分野毒株一致，而疫苗株Onderstepoort、CDV3、SH、Convac等則為H，而2013年Tracie A等[2]報(bào)道的俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)東北虎源CDV分離株H蛋白也具有549 Y的特點(diǎn)。本研究分離株的H蛋白的530位為G，與部分強(qiáng)毒株如A75/17等一致，而與所有疫苗株相比均存在差異，CDV3、SH等為N，而OP株則為S。此外，本研究毒株H蛋白氨基酸序列與其他Asia-1型毒株相比在V47、M50、N77、R110、F198、T245、S265、N277、V337、A365、S388、V522等位點(diǎn)發(fā)生變異，這些關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸的變異，一方面彰顯在高強(qiáng)度疫苗免疫壓力下病毒發(fā)生變異，另一方面究竟這些變異與病毒的感染宿主、病毒的流行特點(diǎn)等是否有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。

H蛋白的糖基化位點(diǎn)的變化與病毒的毒力有明顯關(guān)系，對(duì)本研究毒株H蛋白氨基酸分析表明：潛在N-末端糖基化位點(diǎn)與疫苗株也不同，本毒株具有9個(gè)，而目前最常用的疫苗株Onderstepoort株為4個(gè)、Convac株的糖基化位點(diǎn)為7個(gè)，和其他野毒株一樣，具有309-311位的特有糖基化位點(diǎn)。本研究毒株的H蛋白糖基化位點(diǎn)與目前流行的野毒株相比沒(méi)有發(fā)生明顯變異，但是與現(xiàn)行疫苗株相比存在明顯差異，目前市售疫苗能否給臨床動(dòng)物提供足夠抗體保護(hù)還有待研究。

3.2 犬瘟熱(CDV)的基因型

CDV的基因型與地理位置有關(guān)，基于H基因全長(zhǎng)序列分析，根據(jù)病毒分離株地域流行特點(diǎn)將其分為7個(gè)主要基因型：America-1(疫苗株)、America-2、Asia-1、Asia-2、Europe、Artic-like和European野生型。還有些學(xué)者將其分為Africa、Asia、Argentina等基因型，其實(shí)也是基于病毒地域流行的特點(diǎn)[8]。本研究中虎源CDV分離株屬于Asia-1和國(guó)內(nèi)流行的毒株保持一致，與2013年Tracie A等報(bào)道的俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)東北虎源CDV分離株的基因型(Artic-like)存在明顯差異[2]，這可能與CDV在不同地區(qū)流行株氨基酸之間存在較大差異有關(guān)。本分離株基因型與疫苗株基因型(America-1)也差異較大，這可能與高強(qiáng)度的疫苗免疫壓力下，流行毒株發(fā)生變異的可能性較大。

目前國(guó)內(nèi)尚未有虎源犬瘟熱感染的報(bào)道，CDV不僅僅是引起家犬死亡的第二大病原，同時(shí)也是在全球范圍內(nèi)威脅野生食肉動(dòng)物健康的重要病原，較多動(dòng)物種類在病原的傳播過(guò)程中起著病毒存儲(chǔ)器的作用，而疫苗接種是控制本病發(fā)生的最好方法[9]。而目前并沒(méi)有針對(duì)圈養(yǎng)野生動(dòng)物的犬瘟熱疫苗，市面上針對(duì)寵物的犬瘟熱疫苗應(yīng)用于野生動(dòng)物時(shí)候應(yīng)格外慎重，可能會(huì)引起動(dòng)物的發(fā)病甚至死亡[10]。Seimon等研究中指出通過(guò)免疫家犬來(lái)達(dá)到保護(hù)野外東北虎的目的[2]，因?yàn)橛袞|北虎捕獵家犬的案例發(fā)生，這項(xiàng)建議對(duì)于以豬肉、雞肉為食的圈養(yǎng)虎則不適用，而直接免疫老虎，這顯然存在一定的安全隱患。在疫苗的選擇方面重組載體疫苗在安全性和有效性具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)而應(yīng)該被優(yōu)先推薦，但是由于商品采購(gòu)困難等原因，在實(shí)際的臨床使用中存在一定限制。

本研究在國(guó)內(nèi)首次分離了一株虎源CDV，并對(duì)病毒的H蛋白進(jìn)行系統(tǒng)分析，在目前缺乏野生動(dòng)物犬瘟熱疫苗的情況下，了解流行毒株的分子生物學(xué)特點(diǎn)、流行毒株的病毒變異情況，對(duì)于該病的有效防控有重要意義。同時(shí)也要求野生動(dòng)物研究人員平時(shí)應(yīng)注重對(duì)易感動(dòng)物如小熊貓、虎、狼(Canislupus)等CDV血清學(xué)抗體等數(shù)據(jù)的積累，對(duì)CDV在圈養(yǎng)野生動(dòng)物中的流行情況做詳細(xì)調(diào)查，同時(shí)積極從事專項(xiàng)用于野生動(dòng)物犬瘟熱防控疫苗的研究。

[1] Sakai K，Nagata N，Ami Y，et al.Lethal canine distemper virus outbreak in cynomolgus monkeys in Japan in 2008[J].Journal of Virology，2013，87(2)：1105-1114.

[2] Seimon T A，Miquelle D G，Chang T Y，et al.Canine distemper virus：an emerging disease in wild endangered Amur tigers(Pantheratigrisaltaica)[J].mBio，2013，4(4)：e00410-e00413.

[3] Guo Ling，Yang Shaolin，Wang Chengdong，et al.Phylogenetic analysis of the haemagglutinin gene of canine distemper virus strains detected from giant panda and raccoon dogs in China [J].Virology Journal，2013，10(1)：109.

[4] Kapil S，Allison R W，Johnston L，et al.Canine distemper virus strains circulating among North American dogs[J].Clinical and Vaccine Immunology，2008，15(4)：707-712.

[5] Origgi F C，Plattet P，Sattler U，et al.Emergence of canine distemper virus strains with modified molecular signature and enhanced neuronal tropism leading to high mortality in wild carnivores[J].Veterinary Pathology，2012，49(6)：913-929.

[6] Maes R K，Wise A G，F(xiàn)itzgerald S D，et al.A canine distemper outbreak in Alaska：diagnosis and strain characterization using sequence analysis[J].Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2003，15(3)：213-220.

[7] Terio K A，Craft M E.Canine distemper virus(CDV)in another big cat：should CDV be renamed carnivore distemper virus?[J].mBio，2013，4(5)：e00702-e00713.

[8] Mochizuki M，Hashimoto M，Hagiwara S，et al.Genotypes of canine distemper virus determined by analysis of the hemagglutinin genes of recent isolates from dogs in Japan[J].Journal of Clinical Microbiology，1999，37(9)：2936-2942.

[9] Stanton J B，Givens L，Evermann J F，et al.Immunohistochemical analysis of two strains of lion(Pantheraleo)-adapted canine distemper virus in ferrets(Mustelaputoriusfuro)[J].Veterinary Pathology，2003，40(4)：464-467.

[10] 張曉明，單芬，陳武，等.小熊貓犬瘟熱病毒的分離鑒定及分子特點(diǎn)[J].畜牧與獸醫(yī)，2013，45(10)：60-63.