美洲紅鹮源嗜水氣單胞菌的分離與鑒定

陳 蓉 周 薇 陳 楠 章小小 鄧長林

(江蘇省南京市紅山森林動(dòng)物園獸醫(yī)院，南京，210028)

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是弧菌科氣單胞菌屬，為革蘭氏陰性短桿菌，廣泛分布于自然界的各種水體，是多種水生動(dòng)物的原發(fā)性致病菌，為條件致病菌，是典型的人-獸-魚共患病病原菌[1-2]。臨床上以急性出血性敗血癥為主要特征，慢性感染則主要表現(xiàn)為皮膚潰瘍或腸炎[3]。在野生動(dòng)物中，大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)、北極狐(Alopexlagopus)、海豹(Phocidae)、企鵝(Spheniscidae)、長頸鹿(Giraffacamelopardalis)等均分離到了致病性嗜水氣單胞菌[4-8]。

美洲紅鹮(Eudocimusruber)是棲息在南美洲熱帶及特立尼達(dá)的一種朱鷺，是特立尼達(dá)的國鳥，也是世界上顏色最紅的鳥類，具有極高的觀賞價(jià)值。2016年1月，南京某動(dòng)物園的美洲紅鹮群體中連續(xù)出現(xiàn)4只個(gè)體發(fā)病，均在臨床表現(xiàn)精神沉郁后不久死亡。解剖發(fā)現(xiàn)肝臟出現(xiàn)不同程度血腫，腸道多處出血、卡他，部分腸壁變薄。取其肝臟和腸道內(nèi)容物樣品進(jìn)行致病菌分離培養(yǎng)，依據(jù)所獲菌株生化鑒定、藥敏試驗(yàn)和小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果，以及病死紅鹮病理學(xué)觀察結(jié)果，確定致病性嗜水氣單胞菌為導(dǎo)致美洲紅鹮死亡的病原菌。同時(shí)，在飼喂美洲紅鹮的小黃魚腸道中也分離到致病性嗜水氣單胞菌。

1 研究方法

1.1 細(xì)菌培養(yǎng)

將2只病死美洲紅鹮的肝臟、脾臟、腸道內(nèi)容物樣品無菌接種至血平板中，37℃培養(yǎng)24 h。飼喂美洲紅鹮的小黃魚腸道內(nèi)容物無菌接種至血平板中，37℃培養(yǎng)24 h。

1.2 生化鑒定

經(jīng)革蘭氏染色鏡檢后；經(jīng)Biomerieux微生物鑒定儀，進(jìn)行生化鑒定。

1.3 藥敏試驗(yàn)

利用比濁法在Biomerieux微生物藥敏分析鑒定儀上，對(duì)分離菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，判斷分離細(xì)菌對(duì)常見藥物的敏感性。

1.4 病理學(xué)觀察

取病變肝臟、腸道于中性福爾馬林溶液中固定，進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、透蠟、石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡觀察組織病理學(xué)變化。

1.5 小鼠致病性試驗(yàn)

將15只2周齡普通級(jí)昆明小鼠，在試驗(yàn)室飼養(yǎng)2 d，觀察無異常后隨機(jī)分3組，每組5只。取分離株1和分離株2的18 h肉湯純培養(yǎng)物，按麥?zhǔn)媳葷岱ㄏ♂尦?×108cfu/mL進(jìn)行腹腔注射，每只注射0.1 mL。對(duì)照組注射生理鹽水。觀察小鼠精神狀況、死亡時(shí)間和數(shù)量。無菌接種肝臟內(nèi)容物至血平板培養(yǎng)，并進(jìn)行生化鑒定。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離

從2只病死美洲紅鹮的肝臟和腸道內(nèi)容物、小黃魚腸道中均分離出邊緣光滑、中央凸起、白色的β型溶血性小菌落。

2.2 生化鑒定

經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，細(xì)菌均為陰性短桿菌；經(jīng)Biomerieux微生物鑒定儀，進(jìn)行生化鑒定，細(xì)菌生化試驗(yàn)一致，均為嗜水氣單胞菌。生化結(jié)果如表1。

2.3 藥敏試驗(yàn)

利用比濁法在Biomerieux微生物藥敏分析鑒定儀上，對(duì)該細(xì)菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，判斷細(xì)菌對(duì)19種常見藥物的敏感性。結(jié)果一致，僅對(duì)哌拉西林、亞胺培南耐藥，對(duì)阿莫西林/克拉維酸鉀中介，對(duì)其余16種抗生素敏感，不屬于耐藥菌株(表2)。

表1 嗜水氣單胞菌生化鑒定

Tab.1 The biochemical properties of Aeromonas hydrophila

續(xù)表1

表2 藥敏試驗(yàn)

Tab.2 The results of drug sensitivity test

2.4 病理學(xué)觀察

腸道：黏膜層可見多處不同程度的肉芽腫，肉芽底層可見纖維細(xì)胞，表層為炎性細(xì)胞，提示感染導(dǎo)致慢性腸道潰瘍(圖1)。

肝臟：多處靜脈均見混合血栓，白色部位典型白色血栓結(jié)構(gòu)，紅色部有血小梁，網(wǎng)眼較寬，網(wǎng)眼內(nèi)充滿纖維蛋白和紅細(xì)胞(圖2)。

圖1 腸道病理切片圖(100×)箭頭見肉芽腫Fig.1 Intestinal tract pathological inspection(100×)The arrow saw the granulomae

圖2 肝臟病理切片圖(100×)箭頭見血栓Fig.2 Liver tract pathological inspection(100×)The arrow see thrombosis

2.5 小鼠致病性試驗(yàn)

攻毒組5只小鼠均在12～24 h內(nèi)死亡，對(duì)照組小鼠未見臨床癥狀。解剖攻毒組小鼠，可見肝臟血腫壞死，出血性腸炎，與死亡紅鹮解剖癥狀基本一致。解剖對(duì)照組小鼠，未見異常。從攻毒組小鼠肝臟分離到細(xì)菌，經(jīng)生化鑒定為嗜水氣單胞菌。

3 討論

本文通過對(duì)病死美洲紅鹮的肝臟、腸道進(jìn)行細(xì)菌分離，所分離菌株通過生化鑒定為嗜水氣單胞菌。病死紅鹮病理學(xué)診斷可見肝臟以血栓為主、腸道黏膜層多處出現(xiàn)肉芽腫。另外，在動(dòng)物致病性試驗(yàn)中，小鼠死亡，并分離到該菌，進(jìn)一步證實(shí)了美洲紅鹮感染了具有致病性的嗜水氣單胞菌。在藥敏試驗(yàn)中，該菌僅對(duì)哌拉西林和亞胺培南產(chǎn)生耐藥性，對(duì)阿莫西林/克拉維酸鉀為中介，對(duì)其他16種抗生素均敏感，不屬于耐藥菌群。同時(shí)，值得引起注意的是在其食物——小黃魚的腸道內(nèi)容物中分離到具有致病性的嗜水氣單胞菌，提示美洲紅鹮可能采食了具有致病性嗜水氣單胞菌的小黃魚導(dǎo)致感染。

在野生動(dòng)物中，嗜水氣單胞菌可引起急性出血性敗血癥、腸炎等癥狀，也可與其他細(xì)菌發(fā)生混合感染。韋婷等[8]報(bào)道的長頸鹿爆發(fā)的細(xì)菌感染，確診為嗜水氣單胞菌和大腸桿菌混合感染所致。王永賢等[4]從腹瀉的大熊貓糞便中分離到2株細(xì)菌，鑒定為嗜水氣單胞菌DNA 1群和肺炎克雷白氏菌肺炎亞種。對(duì)死亡美洲紅鹮進(jìn)行病原菌分離鑒定未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌混合感染的情況，結(jié)合解剖癥狀和病理學(xué)診斷，其臨床癥狀以肝臟血栓、出血性腸炎為主。

嗜水氣單胞菌既是條件致病菌，又是原發(fā)致病菌[9]。發(fā)病時(shí)，正處于天氣較冷的時(shí)段，該群美洲紅鹮在進(jìn)入冬季時(shí)就出現(xiàn)食欲減少的現(xiàn)象，造成其機(jī)體抵抗力較差，加之食用了污染致病性嗜水氣單胞菌的小黃魚，促使了疾病的爆發(fā)。

美洲紅鹮主要以甲殼類及小型的水生動(dòng)物，小魚、貝類為食物。隨著黃魚人工工廠化育苗的成功，黃魚海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖規(guī)模蓬勃發(fā)展，也有嗜水氣單胞菌導(dǎo)致黃魚的出血性腸炎的報(bào)道[10]。該群美洲紅鹮，通過及時(shí)更換飼料，切斷傳染源，同時(shí)，加強(qiáng)了環(huán)境、水體的消毒，從而使病情得到了有效的控制。因此，飼養(yǎng)者不僅要定期檢測(cè)淡水魚，還要對(duì)海水魚進(jìn)行檢驗(yàn)，防止將所攜帶的病原菌傳播給珍惜禽鳥。

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