生物表面活性劑產(chǎn)生菌UBQ11—4誘變育種與產(chǎn)物性能研究

門欣++沈衛(wèi)榮++孫曉宇++陳銳++趙玲俠++瞿佳++路鵬鵬

摘要 本研究從石油污染土壤中篩選得到的一株高效生物表面活性劑產(chǎn)生菌BQ11，對其進行分子鑒定，為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），GenBank登錄號為KF111571。BQ11發(fā)酵后產(chǎn)生的表面活性劑可將發(fā)酵培養(yǎng)基表面張力從70 mN/m降低至35 mN/m。發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過薄層色譜及紅外光譜分析，為糖脂類生物表面活性劑。經(jīng)UV誘變后，篩選獲得一株正誘變幅度達28%的高產(chǎn)生物表面活性劑菌株UBQ11-4，糖脂產(chǎn)量從5.3 g/L提高至6.8 g/L。通過對其產(chǎn)物特性及穩(wěn)定性進行研究，發(fā)現(xiàn)該菌株產(chǎn)生的生物表面活性劑對原油的乳化降黏效果良好，9 d后乳化相仍可保持86%。經(jīng)測定，其臨界膠束濃度CMC值為50 mg/L，低于出發(fā)菌株BQ11的CMC值（65 mg/L），并能將培養(yǎng)基的表面張力降低50%以上，有可能應(yīng)用于石油工業(yè)提高采收率和環(huán)境工程的油氣污染生物修復(fù)。

關(guān)鍵詞 生物表面活性劑；表面張力；產(chǎn)生菌株；鑒定；UV誘變；產(chǎn)物性能

中圖分類號 X172 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）03-0187-04

Abstract In this study，a strain（BQ11）was isolated from oil field，which could produce high quantity biosurfactant.BQ11 was identified as Pseudomonas aeruginosa according to the 16S rDNA gene sequence，and the GenBank accession number was KF111571.Using the biosurfactant produced by BQ11，the surface tension of medium reduced from 70 mN/m to 35 mN/m.The fermentation products were assigned to glycolipid by Thin Layer Chromatography（TLC）and Fourier Transform Infared Spectroscopy（FT-IR）analysis.After UV mutagenesis of BQ11，biosurfactant high-producing strain UBQ11-4 was obtained，which positive mutagenicity reached 28%，and the glycolipid production increased from 5.3 g/L to 6.8 g/L.Through the study on the properties and stability of the product，it was found that the biosurfactant produced by this strain had good effects on the emulsification and viscosity reduction of crude oil，and the emulsion phase remained 86% after 9 d.The critical micelle concentration of UBQ11-4 was determined to be 50 mg/L，which was lower than the CMC of BQ-11（65 mg/L）.The surface tension of the medium could be reduced by more than 50%，which may be used for improving oil recovery in petroleum industry and bioremediation of oil and gas pollution in environmental engineering.

Key words biosurfactant；surface tension；producing strain；identification；UV mutagenesis；product property

生物表面活性劑（Biosurfactant）是從生物來源分離得到的一類具有降低表面張力、穩(wěn)定乳化、增加泡沫穩(wěn)定性等表面特性的物質(zhì)[1]。按照生物表面活性劑分子親水基的化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為糖脂類、磷脂、含氨基酸類脂、脂肪酸中性脂等[2-3]。目前研究和應(yīng)用最廣泛的是糖脂，其中又以銅綠假單胞菌生產(chǎn)鼠李糖脂為主[4]。本研究通過微生物育種技術(shù)，對生物表面活性劑產(chǎn)生菌進行誘變選育，提高其生物表面活性劑產(chǎn)量，選育出生物表面活性劑的高產(chǎn)菌株，并對發(fā)酵菌種合成的生物表面活性劑的理化特性（溶血性、表面張力、乳化性能等）和穩(wěn)定性（耐熱、耐高礦化度、耐酸堿性等）進行檢測分析，為生物表面活性劑的深入研究及其在石油工業(yè)與污染土壤修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株的分離與培養(yǎng)

本研究的石油污染土壤樣品來自延長油田七里村采油廠。以血平板作為分離培養(yǎng)基[5]，配方為牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉0.1 g/L、NaCl 5 g/L、脫纖維綿羊血8%，pH值為7.2～7.4。經(jīng)過血平板篩選，挑出產(chǎn)生溶血圈的單菌落保存。

將分離的菌株搖瓶發(fā)酵，培養(yǎng)基配方為酵母提取物1 g/L、甘油20 g/L、（NH4）2SO4 2.65 g/L、NaCl 1.0 g/L、NaNO3 2.125 g/L、CaCl2·2H2O 0.01 g/L、K2HPO4 2.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO4 2.0 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L，pH值為7.2～7.4。發(fā)酵條件為30 ℃下以180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。發(fā)酵結(jié)束后以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心30 min，收集發(fā)酵液上清。endprint

1.2 發(fā)酵液表面張力的測定

將BQ11接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵條件為30 ℃下以180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。發(fā)酵結(jié)束后以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心30 min，棄去沉淀保留發(fā)酵液上清，以未發(fā)酵的培養(yǎng)基為對照，在23～25 ℃條件下，每一批發(fā)酵液上清均用表面張力儀（ZL-3型自動界面張力儀，山東博山同業(yè)分析儀器）測量3次。

1.3 表面活性劑的提取與鑒定

1.3.1 表面活性劑提取。發(fā)酵后收集細菌發(fā)酵液上清，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值為2.0，然后加入等體積的萃取劑混勻，萃取劑為氯仿∶甲醇（2∶1，v∶v）。重復(fù)3次萃取過程，合并有機相，于45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，得到生物表面活性劑粗產(chǎn)物[6]。將提取得到的粗產(chǎn)物溶于50 mL的0.05 mol/L NaHCO3中，以硫酸苯酚法測定糖脂含量[7]。

1.3.2 薄層色譜分析。將生物表面活性劑粗產(chǎn)物溶于氯仿中，預(yù)制板活化后，現(xiàn)用現(xiàn)配展開劑（氯仿∶甲醇=2∶1，v∶v），將點好樣的薄層板放置于層析缸中。樣品展開到一定展距后，取出薄層板噴上顯色劑，于110 ℃烘箱中顯色5 min[8-9]。顯色劑：茚三酮顯色劑，顯紅色則為脂肽；苯酚硫酸試劑，顯棕色則為糖脂；溴百里香酚藍試劑，顯藍綠色則為磷脂和類脂[10-11]。

1.3.3 紅外光譜分析。將樣品層析分離后的顯色帶位置刮下，用氯仿∶甲烷（1∶1，v∶v）提取后于45 ℃減壓蒸干，將得到的樣品溶于甲醇，取1～2 mg樣品并加入200 mg KBr干燥處理后研細，混合壓成透明薄片后進行紅外掃描分析測定[12-14]。

1.4 產(chǎn)表面活性劑菌種鑒定

16S rDNA序列測定：吸取菌株BQ11培養(yǎng)液1 mL置于離心管中，離心收集菌體，按照細菌基因組DNA提取試劑盒（Tiangen）標準化步驟提取待測菌株的基因組DNA。以全基因組DNA為模板，擴增待測菌株的16S rDNA片段[15-16]并測序，將測序結(jié)果于GenBank數(shù)據(jù)庫中做序列相似性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，最終得到待測菌株BQ11的鑒定結(jié)果。

1.5 UV誘變

將菌株BQ11搖瓶發(fā)酵，于30 ℃下以180 r/min振蕩培養(yǎng)，12～16 h后收集菌液，以4 000 r/min離心10 min，收集菌體于100 mL生理鹽水中，以180 r/min振蕩混勻30 min。用生理鹽水將菌體濃度調(diào)至106個/mL，吸取10 mL菌懸液于直徑為9 cm的平皿中備用。UV誘變條件為15 W、38 cm，誘變劑量為15、30、45、60、75 s，紫外燈預(yù)熱30 min，以未經(jīng)紫外照射的菌懸液為空白對照，對菌懸液進行梯度稀釋。

取各稀釋度的菌懸液0.2 mL涂布于血平板，于30 ℃恒溫避光培養(yǎng)48 h后計數(shù)，計算不同照射時間的相對致死率。

1.6 表面活性劑乳化性能及臨界膠束濃度測定

1.6.1 乳化性能測定。取發(fā)酵液5 mL與原油等體積混合于試管中。超聲處理30 min，于37 ℃放置10 d，每間隔12 h測量油相和乳化液的體積[17]，并繪制曲線。

1.6.2 臨界膠束濃度測定。在室溫下采用吊環(huán)法測定不同質(zhì)量濃度的表面活性劑溶液的表面張力，繪制表面活性劑濃度與表面張力曲線，最終可求得臨界膠束濃度CMC[18]。

1.7 表面活性劑穩(wěn)定性分析

將培養(yǎng)72 h的細菌發(fā)酵液離心后去除菌體，收集發(fā)酵液上清，測定發(fā)酵液中表面活性劑對溫度、酸堿度及鹽離子濃度的穩(wěn)定性。在40～100 ℃的范圍內(nèi)，每隔10 ℃為一個測試點，在不同測試點溫度下，取發(fā)酵原液處理2 h，冷卻至25 ℃室溫后測定其表面張力。用NaOH和HCl調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值，檢測該表面活性劑溶液在pH值為2～12時的表面張力，并分析該表面活性劑對不同pH值的耐受性。在25 ℃室溫條件下，在發(fā)酵原液中加入濃度梯度為0～20%的NaCl，測定其表面張力，分析該表面活性劑對鹽濃度的耐受性。

2 結(jié)果與分析

2.1 血平板法分離篩選菌株

以血平板作為分離培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后挑取可產(chǎn)生溶血圈的單菌落保存，如圖1所示。

2.2 發(fā)酵液表面張力

菌株BQ11發(fā)酵培養(yǎng)后產(chǎn)生的表面活性劑可將發(fā)酵液表面張力從70 mN/m降為35 mN/m。

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物鑒定

將提取得到的粗產(chǎn)物溶于50 mL的0.05 mol/L NaHCO3中，以硫酸苯酚法測定糖脂含量[6]，經(jīng)測定，菌株BQ11發(fā)酵產(chǎn)物中糖脂產(chǎn)量達5.3 g/L。

通過薄層色譜分析顯示，菌株BQ11主要產(chǎn)糖脂類生物表面活性劑。圖2為紅外光譜分析結(jié)果，吸收峰表示產(chǎn)物中含有以下基團。3 417.39/cm波段吸收峰為羥基峰，表明分子中有大量羥基存在；1 643.48/cm波段吸收峰表明分子中存在C？襒O雙鍵振動，說明該化合物中含有飽和脂肪鏈；2 917.39/cm波段吸收峰表明分子中存在糖類分子的C—H伸縮振動；1 408.70～1 547.83/cm波段吸收峰表明存在C—H變角振動，包括CH2—和CH3—，表明存在大量烷烴的鏈狀結(jié)構(gòu)，有較多CH3—CH2—結(jié)構(gòu)單元；C—O—C伸縮振動（1 108.70/cm）表明該化合物結(jié)構(gòu)中存在羧酸酯基團。圖中未發(fā)現(xiàn)氨基峰，進一步確定該化合物不屬于脂肽類。綜上可知，產(chǎn)物為糖脂類生物表面活性劑[19]。

2.4 菌種鑒定

本試驗通過16S rDNA序列分析，鑒定菌株BQ11長度為1 411 bp的PCR產(chǎn)物與Pseudomonas aeruginosa（AJ888983）的核苷酸序列同源性達到99%，菌株BQ11的16S rDNA序列GenBank登錄號為KF111571。與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行相似性分析，采用MEGA5.1軟件包中的Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），顯示菌株BQ11與Pseudomonas aeruginosa（AJ888983）具有相隔最近的親緣關(guān)系。鑒定菌株BQ11為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。endprint

2.5 UV誘變篩選

將不同誘變劑量下得到的菌懸液涂布于血平板，遮光培養(yǎng)48 h后計數(shù)，計算不同紫外照射時間下的相對致死率，挑選溶血圈較大的菌落，通過搖瓶發(fā)酵，離心去除菌體，提取生物表面活性劑，并用苯酚硫酸法直接測定糖脂含量，選出每個致死率下正變幅度較大的菌株，最后確定UV誘變劑量以及誘變后糖脂產(chǎn)量最高的菌株（表1）。結(jié)果表明，不同劑量處理均可獲得正誘變菌株；UV 60 s處理后可獲得糖脂產(chǎn)量達6.8 g/L的正誘變菌株，正誘變幅度達28%。

2.6 乳化性能測定

通過測定表面活性劑的乳化性能可以考察表面活性劑的特性。本研究測定了菌株UBQ11-4和BQ11的乳化性能，由圖4可知，隨著時間的延長，菌株UBQ11-4和BQ11的發(fā)酵液和原油的乳化相體積逐漸減少，但穩(wěn)定性良好，在108 h內(nèi)都可保持乳化相體積在90%左右。菌株UBQ11-4發(fā)酵產(chǎn)生的表面活性劑對原油的乳化降粘效果優(yōu)于BQ11。說明誘變后菌株UBQ11-4產(chǎn)生更多的表面活性劑，對油水界面的親和力更強，使得乳化相保持穩(wěn)定。

2.7 臨界膠束濃度

CMC是表面活性劑溶液性質(zhì)發(fā)生顯著變化的一個分水嶺，CMC值對表面活性劑的研究有著極其重要的參考價值。圖5表明，菌株BQ11和UBQ11-4產(chǎn)生的表面活性劑濃度達到CMC時，表面張力降到最低；而表面活性劑濃度繼續(xù)增大超過CMC后，液體表面張力沒有變化，保持在最低值。表2為菌株UBQ11-4和BQ11發(fā)酵產(chǎn)生的生物表面活性劑的臨界膠束濃度，經(jīng)誘變選育得到的菌株UBQ11-4產(chǎn)生的表面活性劑的CMC小于出發(fā)菌株BQ11。

2.8 產(chǎn)物對溫度、pH值及鹽離子濃度的穩(wěn)定性分析

生物表面活性劑對不同溫度、pH值和礦化度條件的耐受性和穩(wěn)定性將直接影響到表面活性劑在相對復(fù)雜環(huán)境和惡劣條件下的應(yīng)用。本研究通過測定不同溫度、pH值和礦化度條件下UBQ11-4與BQ11發(fā)酵液表面張力的變化，從而推斷出在極端條件下該表面活性劑的表面活性和生理活性。

通過測定UBQ11-4與BQ11發(fā)酵液在高NaCl條件下表面張力（圖6）可以得出，2株菌株產(chǎn)生的表面活性劑在鹽濃度為20%以內(nèi)均有一定的生理活性，在10%的鹽濃度范圍內(nèi)表面活性穩(wěn)定，在10%～20%的范圍內(nèi)該產(chǎn)劑的表面活性會受到影響，降低發(fā)酵液表面張力的能力有所下降，但依然具有生理活性。

由圖7可以看出，UBQ11-4與BQ11菌株發(fā)酵產(chǎn)生的表面活性劑對溫度有一定的耐受性，在40～100 ℃的范圍內(nèi)，發(fā)酵液的表面張力基本穩(wěn)定。

由圖8可以看出，酸堿度對生物表面活性劑表面活性與生理活性影響較顯著，在pH值為5～8時，菌株UBQ11-4和BQ11發(fā)酵產(chǎn)生的表面活性劑生理活性最高，發(fā)酵液表面張力能降低至30～35 mN/m左右。在pH<5和pH>8時，菌株UBQ11-4和BQ11產(chǎn)生的表面活性劑表面活性有所降低，UBQ11-4發(fā)酵液的表面張力能降低至40 mN/m左右，而BQ11發(fā)酵液的表面張力能降低至50 mN/m左右。從試驗結(jié)果可以推論，由于UBQ11-4產(chǎn)表面活性劑高于BQ11，因而在同等條件下，UBQ11-4發(fā)酵液的表面張力低于BQ11；酸堿度主要通過影響表面活性劑在溶液中的溶解度，進而影響表面活性劑降低液體表面張力的能力。

3 討論

生物表面活性劑在石油采收和生物修復(fù)油氣開采造成的環(huán)境污染等方面具有巨大應(yīng)用潛力[20-22]。目前生物表面活性劑只有少數(shù)產(chǎn)品走向市場，大多數(shù)處于試驗研究階段，沒有進行大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，原因是經(jīng)濟成本較高限制其廣泛應(yīng)用，據(jù)估計，生物表面活性劑是化學(xué)生物表面活性劑成本的3～10倍[23]。開發(fā)生物表面活性劑的應(yīng)用潛力、降低其生產(chǎn)成本是當(dāng)前研究開發(fā)的熱點和主要發(fā)展方向，選育出合成生物表面活性劑的高產(chǎn)微生物，設(shè)計高生產(chǎn)力的發(fā)酵工藝和經(jīng)濟有效的分離純化方法、用先進的下游技術(shù)等方法提高生物表面活性劑的發(fā)酵產(chǎn)率，以降低其生產(chǎn)成本。

本研究從陜北油田地區(qū)土壤中篩選出產(chǎn)生物表面活性劑的菌株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）BQ11，對其搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后可將發(fā)酵培養(yǎng)基表面張力從70 mN/m降低至35 mN/m。以該野生菌株為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外誘變后，篩選獲得菌株UBQ11-4，不僅能夠提升糖脂產(chǎn)量（從5.3 g/L提高至6.8 g/L），而且菌株UBQ11-4產(chǎn)生的生物表面活性劑特性（乳化性能、CMC）優(yōu)于BQ11。

通過對其產(chǎn)物穩(wěn)定性研究，誘變選育獲得的菌株UBQ11-4發(fā)酵產(chǎn)生的表面活性劑在不同溫度、pH值和礦化度條件下保持良好的表面活性和生理活性，特別是對pH值的耐受性要優(yōu)于出發(fā)菌株BQ11。

本研究對微生物合成生物表面活性劑進行研究，通過微生物育種技術(shù)誘變選育生物表面活性劑高產(chǎn)菌株，為進一步將生物表面活性劑技術(shù)應(yīng)用于改善貧油層驅(qū)油性能以及油氣污染土壤的生物修復(fù)打下基礎(chǔ)。對生物表面活性劑的深入研究將為其成為化學(xué)合成表面活性劑的替代品提供理論依據(jù)和技術(shù)保證，對石油工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有積極的推動作用。

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