高效液相色譜法檢測(cè)蛋及蛋制品中氟苯尼考?xì)埩袅?/h1>
2018-03-16 22:09:11陳芩章劍胡潔曹丹羅干
現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技 2018年3期
陳芩 章劍 胡潔 曹丹 羅干
摘要 建立了一種蛋及蛋制品中氟苯尼考?xì)埩袅繙y(cè)定的高效液相色譜法（HPLC）。經(jīng)乙酸乙酯提取分離，正己烷脫脂后，采用C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以水-甲醇（60∶40）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)224 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫40 ℃進(jìn)行定量分析。在濃度為0.01～10.00 μg/mL范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好（相關(guān)系數(shù)R>0.999 9），檢出限為0.01 μg/mL。該方法成本較低，操作簡(jiǎn)便，無(wú)雜質(zhì)干擾，分析快速，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于蛋及蛋制品中氟苯尼考?xì)埩袅康臋z測(cè)分析。
關(guān)鍵詞 氟苯尼考；高效液相色譜法；蛋及蛋制品；殘留量
中圖分類(lèi)號(hào) S859.84 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2018）03-0259-02
Abstract The method for florfenicol residue in the eggs and egg products by HPLC was established. The samples were extracted with ethyl-acetate and defatted with n-hexane.The chromatogram conditions were as follows：C18 chromatographic column（4.6 mm×250 mm，5 μm）was used，water and methanol（volume ratio was 60∶40）was as the mobile phase，the flow rate was 1.0 mL/min，determine wavelength was 224 nm，injection volume was 20 μL and column temperature was 40 ℃.In the concentration range of 0.01-10.00 μg/mL，the linear relationship of the standard curve was good（correlation coefficient R>0.999 9），the detection limit was 0.01 μg/mL.This method has the advantages of low cost，simple operation，no impurity interference，quick analysis and accurate result，and is suitable for the detection and analysis of florfenicol residues in eggs and egg products.
Key words florfenicol；HPLC；egg and egg product；residue
氟苯尼考（Florfenicol）為甲砜霉素的單氟衍生物，又名氟甲砜霉素，是20世紀(jì)80年代后期成功研制的一種新的獸醫(yī)專(zhuān)用氯霉素類(lèi)廣譜抗菌藥[1-2]。因?yàn)槠湓隗w內(nèi)極易吸收，分布較為廣泛，對(duì)敏感菌所引發(fā)的動(dòng)物細(xì)菌性疾病具有極佳的治療效果，對(duì)呼吸道感染以及腸道感染的防治效果顯著，所以廣泛地應(yīng)用于畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中[3]。但是，氟苯尼考在動(dòng)物性食品及動(dòng)物源性食品中的殘留對(duì)人體存在潛在的危害，可能會(huì)損害人體骨髓造血機(jī)能，引起粒細(xì)胞缺乏病、再生障礙性貧血和溶血性貧血，嚴(yán)重者可致死。因此，該藥物在動(dòng)物源性食品中的殘留會(huì)嚴(yán)重影響到人類(lèi)的生命安全[4]。
目前，用于檢測(cè)氟苯尼考在動(dòng)物源性食品中殘留的方法主要有高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法以及液質(zhì)聯(lián)用法，其中高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法的應(yīng)用最為廣泛[5]。相比之下液質(zhì)聯(lián)用法成本較高，前處理較為復(fù)雜，很難得到普及，因而建立一種方便快捷、定量準(zhǔn)確、線性關(guān)系良好的高效液相色譜法具有重要的實(shí)際意義[6]。本試驗(yàn)建立了蛋及蛋制品中氟苯尼考?xì)埩袅繙y(cè)定的高效液相色譜法，適用于鮮蛋及以鮮蛋為原料的皮蛋、咸蛋等制品中氟苯尼考?xì)埩袅康臏y(cè)定。
1 材料與方法
1.1 試劑與儀器
1.1.1 試劑：氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品（純度為99.82%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司），乙酸乙酯（AR），甲醇（HPLC），正己烷（AR），氫氧化銨（25%～28%），無(wú)水硫酸鈉（AR）。
1.1.2 儀器：高效液相色譜儀（Agilent 1200，美國(guó)安捷倫科技有限公司）；電子分析天平（AUY-220，日本島津）；渦旋混合器（WH-2，金壇市新航儀器廠）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（TGL-16M，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；超聲波清洗儀（AS10200T-10L，天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA，上海生化儀器廠）。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 樣品前處理。
（1）試樣提取。分別稱(chēng)取均質(zhì)后試樣5 g（精確至0.000 1 g），置于50 mL離心管中，依次加入乙酸乙酯30 mL，氫氧化銨0.9 mL，無(wú)水硫酸鈉5 g，渦旋1 min，超聲提取5 min，10 000 r/min 離心5 min，將上清液移至150 mL雞心瓶中，殘?jiān)?0 mL乙酸乙酯按上述步驟重復(fù)提取1次，合并提取液，45 ℃旋蒸近干。
（2）試樣凈化。向雞心瓶中的殘?jiān)尤? mL水溶解，渦旋1 min，超聲提取5 min，加入3 mL正己烷渦旋1 min，靜置分層，棄掉上層有機(jī)相，再加入3 mL正己烷重復(fù)凈化1次，靜置分層后，取下層水相至5 mL離心管中，于11 000 r/min 條件下離心10 min，將離心后的清液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，待檢測(cè)。
1.2.2 儀器條件。檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；色譜柱為T(mén)opsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為水∶甲醇（60∶40）；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為20 μL；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為224 nm。
2 結(jié)果與分析
2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線
采用上述方法進(jìn)行檢測(cè)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線類(lèi)型為線性回歸，橫坐標(biāo)為氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度，縱坐標(biāo)為氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)使用液峰面積，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，線性回歸方程為y=4 097.3x-29.686圖1。由此可見(jiàn)，本方法分離效果明顯，且線性關(guān)系良好。同時(shí)測(cè)得氟苯尼考?xì)埩袅吭诒痉椒ㄖ械臋z出限為0.01 μg/mL。
2.2 氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)使用液試驗(yàn)結(jié)果
由圖2、3可以看出，本試驗(yàn)方法得出的色譜圖基線穩(wěn)定、峰型理想，且光譜圖具有明顯的代表性，可以在保留時(shí)間的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)目標(biāo)樣品進(jìn)行定性分析，對(duì)氟苯尼考檢測(cè)方法的進(jìn)一步研究有著深遠(yuǎn)的意義。
2.3 加標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果
在本試驗(yàn)色譜條件下，選取雞蛋、鴨蛋、皮蛋以及咸蛋4種樣品，采用樣品加標(biāo)的方法對(duì)本方法的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證，得到4種樣品與各自加標(biāo)樣品的色譜圖對(duì)比結(jié)果（圖4～7）。
由對(duì)比色譜圖結(jié)果可以看出，各樣品按本試驗(yàn)方法處理后，目標(biāo)物出峰時(shí)間穩(wěn)定且在該時(shí)間范圍內(nèi)均無(wú)雜質(zhì)干擾，4種加標(biāo)樣品峰型依然保持良好，無(wú)分叉、無(wú)拖尾現(xiàn)象，響應(yīng)效果顯著。
3 結(jié)論
本試驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)蛋雞蛋制品中氟苯尼考?xì)埩袅窟M(jìn)行了測(cè)定，通過(guò)試驗(yàn)確定了該試驗(yàn)條件下氟苯尼考的出峰時(shí)間、線性范圍、檢出限以及光譜圖。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，本方法不僅靈敏度高、精確度好，且快速經(jīng)濟(jì)，是一種方便、快捷、準(zhǔn)確、有效的蛋及蛋制品中氟苯尼考?xì)埩袅繙y(cè)定方法，對(duì)動(dòng)物源性食品的研究具有重要的意義。
4 參考文獻(xiàn)
[1] 陳進(jìn).氟苯尼考在豬體內(nèi)混飼給藥藥動(dòng)學(xué)研究[J].畜禽業(yè)，2011（7）：32-35.
[2] 魏海濤，方秋華，曾振靈，等.高效液相色譜法測(cè)定豬血漿中氟苯尼考的含量[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2010，35（3）：31-33.
[3] 殷平，陳舜勝，鄧曉軍，等.液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)水產(chǎn)品中氯霉素、氟苯尼考和甲砜氯霉素的殘留量[J].現(xiàn)代食品科技，2007，23（10）：83-87.
[4] 劉智宏，黃耀凌，汪霞，等.水產(chǎn)品中甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺酶聯(lián)免疫多殘留測(cè)定[J].中國(guó)獸藥雜志，2010，44（12）：1-5.
[5] 劉永濤，艾曉輝，李榮，等.水產(chǎn)品中氟苯尼考和氟苯尼考胺的高效液相色譜熒光法同時(shí)測(cè)定[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2008，27（3）：316-318.
[6] ORLANDO E A，COSTA ROQUE A G，LOSEKANN M E，et al.UPLC-MS/MS determination of florfenicol and florfenicol amine antimicrobial residues in tilapia muscle.[J].Journal of Chromatography B，2016，1035：8-15.
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關(guān)鍵詞 氟苯尼考；高效液相色譜法；蛋及蛋制品；殘留量
中圖分類(lèi)號(hào) S859.84 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2018）03-0259-02
Abstract The method for florfenicol residue in the eggs and egg products by HPLC was established. The samples were extracted with ethyl-acetate and defatted with n-hexane.The chromatogram conditions were as follows：C18 chromatographic column（4.6 mm×250 mm，5 μm）was used，water and methanol（volume ratio was 60∶40）was as the mobile phase，the flow rate was 1.0 mL/min，determine wavelength was 224 nm，injection volume was 20 μL and column temperature was 40 ℃.In the concentration range of 0.01-10.00 μg/mL，the linear relationship of the standard curve was good（correlation coefficient R>0.999 9），the detection limit was 0.01 μg/mL.This method has the advantages of low cost，simple operation，no impurity interference，quick analysis and accurate result，and is suitable for the detection and analysis of florfenicol residues in eggs and egg products.
Key words florfenicol；HPLC；egg and egg product；residue
氟苯尼考（Florfenicol）為甲砜霉素的單氟衍生物，又名氟甲砜霉素，是20世紀(jì)80年代后期成功研制的一種新的獸醫(yī)專(zhuān)用氯霉素類(lèi)廣譜抗菌藥[1-2]。因?yàn)槠湓隗w內(nèi)極易吸收，分布較為廣泛，對(duì)敏感菌所引發(fā)的動(dòng)物細(xì)菌性疾病具有極佳的治療效果，對(duì)呼吸道感染以及腸道感染的防治效果顯著，所以廣泛地應(yīng)用于畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中[3]。但是，氟苯尼考在動(dòng)物性食品及動(dòng)物源性食品中的殘留對(duì)人體存在潛在的危害，可能會(huì)損害人體骨髓造血機(jī)能，引起粒細(xì)胞缺乏病、再生障礙性貧血和溶血性貧血，嚴(yán)重者可致死。因此，該藥物在動(dòng)物源性食品中的殘留會(huì)嚴(yán)重影響到人類(lèi)的生命安全[4]。
目前，用于檢測(cè)氟苯尼考在動(dòng)物源性食品中殘留的方法主要有高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法以及液質(zhì)聯(lián)用法，其中高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法的應(yīng)用最為廣泛[5]。相比之下液質(zhì)聯(lián)用法成本較高，前處理較為復(fù)雜，很難得到普及，因而建立一種方便快捷、定量準(zhǔn)確、線性關(guān)系良好的高效液相色譜法具有重要的實(shí)際意義[6]。本試驗(yàn)建立了蛋及蛋制品中氟苯尼考?xì)埩袅繙y(cè)定的高效液相色譜法，適用于鮮蛋及以鮮蛋為原料的皮蛋、咸蛋等制品中氟苯尼考?xì)埩袅康臏y(cè)定。
1 材料與方法
1.1 試劑與儀器
1.1.1 試劑：氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品（純度為99.82%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司），乙酸乙酯（AR），甲醇（HPLC），正己烷（AR），氫氧化銨（25%～28%），無(wú)水硫酸鈉（AR）。
1.1.2 儀器：高效液相色譜儀（Agilent 1200，美國(guó)安捷倫科技有限公司）；電子分析天平（AUY-220，日本島津）；渦旋混合器（WH-2，金壇市新航儀器廠）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（TGL-16M，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；超聲波清洗儀（AS10200T-10L，天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA，上海生化儀器廠）。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 樣品前處理。
（1）試樣提取。分別稱(chēng)取均質(zhì)后試樣5 g（精確至0.000 1 g），置于50 mL離心管中，依次加入乙酸乙酯30 mL，氫氧化銨0.9 mL，無(wú)水硫酸鈉5 g，渦旋1 min，超聲提取5 min，10 000 r/min 離心5 min，將上清液移至150 mL雞心瓶中，殘?jiān)?0 mL乙酸乙酯按上述步驟重復(fù)提取1次，合并提取液，45 ℃旋蒸近干。
（2）試樣凈化。向雞心瓶中的殘?jiān)尤? mL水溶解，渦旋1 min，超聲提取5 min，加入3 mL正己烷渦旋1 min，靜置分層，棄掉上層有機(jī)相，再加入3 mL正己烷重復(fù)凈化1次，靜置分層后，取下層水相至5 mL離心管中，于11 000 r/min 條件下離心10 min，將離心后的清液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，待檢測(cè)。
1.2.2 儀器條件。檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；色譜柱為T(mén)opsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為水∶甲醇（60∶40）；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為20 μL；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為224 nm。
2 結(jié)果與分析
2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線
采用上述方法進(jìn)行檢測(cè)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線類(lèi)型為線性回歸，橫坐標(biāo)為氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度，縱坐標(biāo)為氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)使用液峰面積，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，線性回歸方程為y=4 097.3x-29.686圖1。由此可見(jiàn)，本方法分離效果明顯，且線性關(guān)系良好。同時(shí)測(cè)得氟苯尼考?xì)埩袅吭诒痉椒ㄖ械臋z出限為0.01 μg/mL。
2.2 氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)使用液試驗(yàn)結(jié)果
由圖2、3可以看出，本試驗(yàn)方法得出的色譜圖基線穩(wěn)定、峰型理想，且光譜圖具有明顯的代表性，可以在保留時(shí)間的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)目標(biāo)樣品進(jìn)行定性分析，對(duì)氟苯尼考檢測(cè)方法的進(jìn)一步研究有著深遠(yuǎn)的意義。
2.3 加標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果
在本試驗(yàn)色譜條件下，選取雞蛋、鴨蛋、皮蛋以及咸蛋4種樣品，采用樣品加標(biāo)的方法對(duì)本方法的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證，得到4種樣品與各自加標(biāo)樣品的色譜圖對(duì)比結(jié)果（圖4～7）。
由對(duì)比色譜圖結(jié)果可以看出，各樣品按本試驗(yàn)方法處理后，目標(biāo)物出峰時(shí)間穩(wěn)定且在該時(shí)間范圍內(nèi)均無(wú)雜質(zhì)干擾，4種加標(biāo)樣品峰型依然保持良好，無(wú)分叉、無(wú)拖尾現(xiàn)象，響應(yīng)效果顯著。
3 結(jié)論
本試驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)蛋雞蛋制品中氟苯尼考?xì)埩袅窟M(jìn)行了測(cè)定，通過(guò)試驗(yàn)確定了該試驗(yàn)條件下氟苯尼考的出峰時(shí)間、線性范圍、檢出限以及光譜圖。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，本方法不僅靈敏度高、精確度好，且快速經(jīng)濟(jì)，是一種方便、快捷、準(zhǔn)確、有效的蛋及蛋制品中氟苯尼考?xì)埩袅繙y(cè)定方法，對(duì)動(dòng)物源性食品的研究具有重要的意義。
4 參考文獻(xiàn)
[1] 陳進(jìn).氟苯尼考在豬體內(nèi)混飼給藥藥動(dòng)學(xué)研究[J].畜禽業(yè)，2011（7）：32-35.
[2] 魏海濤，方秋華，曾振靈，等.高效液相色譜法測(cè)定豬血漿中氟苯尼考的含量[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2010，35（3）：31-33.
[3] 殷平，陳舜勝，鄧曉軍，等.液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)水產(chǎn)品中氯霉素、氟苯尼考和甲砜氯霉素的殘留量[J].現(xiàn)代食品科技，2007，23（10）：83-87.
[4] 劉智宏，黃耀凌，汪霞，等.水產(chǎn)品中甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺酶聯(lián)免疫多殘留測(cè)定[J].中國(guó)獸藥雜志，2010，44（12）：1-5.
[5] 劉永濤，艾曉輝，李榮，等.水產(chǎn)品中氟苯尼考和氟苯尼考胺的高效液相色譜熒光法同時(shí)測(cè)定[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2008，27（3）：316-318.
[6] ORLANDO E A，COSTA ROQUE A G，LOSEKANN M E，et al.UPLC-MS/MS determination of florfenicol and florfenicol amine antimicrobial residues in tilapia muscle.[J].Journal of Chromatography B，2016，1035：8-15.
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