一種傳統(tǒng)發(fā)酵酵子細菌多樣性及揮發(fā)性發(fā)酵產(chǎn)物分析

馬凱,武會娟,劉悅,陳爾凝,杜美紅，李太華,王衍生,高麗娟,*

1(北京市理化分析測試中心，北京市基因測序與功能分析工程技術(shù)研究中心，北京市食品安全分析測試工程技術(shù)研究中心，北京，100094) 2(北京旗艦食品集團有限公司，北京，100194)

饅頭作為傳統(tǒng)發(fā)酵面食的典型代表，在我國特別是北方地區(qū)日常生活中占有重要的地位。饅頭的發(fā)酵劑大致分為兩類，一類是傳統(tǒng)的發(fā)酵劑，一般被稱為“酵子”“老面”及“面肥”等[1]，另一類是現(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)的活性干酵母、鮮酵母及饅頭自發(fā)粉等?；钚愿山湍笧閱我痪N發(fā)酵，與傳統(tǒng)發(fā)酵劑的混菌體系發(fā)酵相比，發(fā)酵的饅頭風(fēng)味平淡、香氣不佳，總體的感官品質(zhì)低，復(fù)蒸性能差[2]。傳統(tǒng)饅頭發(fā)酵酵子中除含有酵母菌外，還有包括乳酸菌在內(nèi)的豐富的細菌菌群[3]，其在面團發(fā)酵過程中起到協(xié)同酵母菌進行糖化、蛋白分解、酯化、產(chǎn)氣的作用，在豐富了發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝物質(zhì)和增加了營養(yǎng)元素的同時，還能夠給醒蒸后的饅頭增添獨特的香味[4]，因而發(fā)酵的面食感官品質(zhì)更佳。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 酵子樣本、面粉及干酵母

酵子樣品取自北京地區(qū)一優(yōu)質(zhì)傳統(tǒng)饅頭發(fā)酵酵子，低溫運輸至實驗室，立即進行菌株分離培養(yǎng)；高活性干酵母(安琪酵母(赤峰)有限公司)；面粉(北京糧海食品有限公司旗艦面粉)。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)、MRS培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

TaqDNA聚合酶、DL2000 Marker，寶生物工程大連有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司；TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit， Takara(大連)；pGEM-T克隆試劑盒、JM109感受態(tài)細胞，Promega(美國)；HinfI、MspI，New England BioLabs(美國)。

IF-A接種液、AN-IF接種液、GEN III微孔板、AN微孔板、BUG培養(yǎng)基、BUA培養(yǎng)基，Biolog公司(美國)；其他化學(xué)藥品均為進口分析純產(chǎn)品。

其他有機試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器

ZSD-A1090生化培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器有限公司；厭氧罐，三菱，日本；Gen III Microstation自動微生物鑒定系統(tǒng)，Biolog(美國)。C1000TM Thermal Cycler PCR儀、UNIVERSAL HOOD II凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad(美國)；固相微萃取手動進樣手柄、DVB/CA/PDMS(2 cm，50/30 μm)纖維頭，Supelco(美國)；2010氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，Shimadzu(日本)。

1.2 菌株的分離純化及鑒定

1.2.1 菌株分離純化及形態(tài)學(xué)觀察

從酵子內(nèi)及酵子表面各取5 g面，合并轉(zhuǎn)置于盛有90 mL磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)的無菌三角瓶內(nèi)，充分振蕩30 min，使酵子樣品盡可能分散均勻制成酵子懸液。梯度稀釋后分別涂布到NA和MRS培養(yǎng)基上，分別置于36 ℃(NA)和30 ℃(MRS)培養(yǎng)48 h(MRS培養(yǎng)基置于厭氧罐中培養(yǎng))。進一步純化后觀察其在培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征；并利用光學(xué)顯微鏡進行菌體形態(tài)特征觀察。

1.2.2 菌株16S rDNA序列分析

提取分離菌株基因組DNA，并以此DNA為模板，利用細菌通用引物針對性地對16S rDNA序列進行擴增，PCR條件參見文獻[5]。序列測序后使用Lasergene軟件內(nèi)部的SeqMan對測序結(jié)果進行拼接及引物序列校準。將拼接后的序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對。

1.2.3 菌株的生理生化特性分析

將從NA和MRS培養(yǎng)基上分離得到的菌株分別使用Biolog的GEN III板(需氧菌)或AN板(厭氧菌)進行碳源利用情況檢測，通過微孔板上顯紫色孔所產(chǎn)生的指紋圖譜同Biolog數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對，得到針對95種碳源利用情況最相似的鑒定菌株。

1.3 克隆文庫分析

1.3.1 核酸提取及擴增

按照1.2.1方法制備酵子懸液。將酵子懸液分3次轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，50 r/min離心5 min，取上清液至新50 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min，棄上清，提取試劑盒提取酵子中總DNA。

以酵子總DNA為模板，針對性地對其中細菌16S rDNA序列進行擴增，PCR擴增體系及PCR反應(yīng)條件同1.2.2，產(chǎn)物用1%的瓊脂糖進行檢測。

1.3.2 16S rDNA克隆文庫構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物純化后，參照文獻[6]構(gòu)建文庫。

1.3.3 擴增性rDNA的限制酶切分析(Amplified rDNA Restriction Analysis，ARDRA)

使用限制性內(nèi)切酶HinfI、MspI進行酶切分析，具體方法參見文獻[6]。電泳圖用Quantity one軟件分析，篩選出不同帶型克隆子。挑取酶切分型不同的克隆子進行雙向測序。使用Lasergene軟件內(nèi)部的SeqMan對測序結(jié)果進行拼接及引物序列校準。將拼接后的序列提交到NCBI進行BLAST比對。

1.4 饅頭樣品制作方法

老酵饅頭及酵母饅頭做法參照文獻[4]。

1.5 揮發(fā)性代謝產(chǎn)物分析

1.5.1 固相微萃取操作方法及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測條件

準確稱取500 mg饅頭樣品(每種饅頭設(shè)置3個重復(fù))于15 mL氣相頂空樣品瓶中，加入5 mL預(yù)冷(4 ℃)去離子水，加終濃度為10 mmol/L內(nèi)標4-甲基-2-戊醇(0.001 0 g/mL)。

固相微萃取操作方法及樣品檢測用的色譜及質(zhì)譜條件同參考文獻[4]方法一致。

1.5.2 揮發(fā)性產(chǎn)物的鑒定及數(shù)據(jù)分析

對檢測結(jié)果的定性分析，以計算機檢索NIST08譜庫、人工解析圖譜，結(jié)合文獻對照共同確定揮發(fā)性成分。通過將檢測到的揮發(fā)性物質(zhì)與內(nèi)標物峰面積的對比確定揮發(fā)性成分的含量。

使用SPSS(PASW Statistics 18.0，美國)對揮發(fā)性成分的含量進行單因素變量分析(Analysis of Variance，ANOVA)，統(tǒng)計量采用描述性和方差同質(zhì)性檢驗，顯著性p<0.05。采用主成分分析方法對兩種饅頭樣品進行分析，以期發(fā)現(xiàn)兩種饅頭之間的異同，及造成差異的成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離培養(yǎng)鑒定結(jié)果

通過傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)共獲得26株菌株，其菌落及菌體形態(tài)特征如表1中分析所示。其PCR產(chǎn)物測序結(jié)果Blast比對結(jié)果見表1中16S rDNA序列相似性分析。

根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果及16S rDNA測序比對結(jié)果，選取非重復(fù)菌種的代表菌種共計5株提交GenBank并獲得登錄號KX247764-KX247768，如表1所示。

將5株菌株進行Biolog生化鑒定，得到最相似的鑒定菌株ID。其中MRS-3和NA-20鑒定結(jié)果中SIM值沒有大于0.5的比對菌株，參照其測序鑒定結(jié)果(Weissellacibaria和Acetobactermalorum)發(fā)現(xiàn)，Biolog數(shù)據(jù)庫中沒有此2株菌。

通過以上分析，查詢相關(guān)分類書籍[7-8]并結(jié)合相關(guān)文獻[9-10]，綜合結(jié)果見表1。

2.2 克隆及酶切(ARDRA)鑒定結(jié)果

經(jīng)瓊脂糖電泳驗證后去除4個假陽性克隆子(見圖1-A)，Quantity one軟件分析(見圖1-B)篩選出不同帶型克隆子進行測序，將序列提交GenBank，獲得登錄號KX247769-KX247777，見表2。將表1與表2中菌株序列合并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。

表1 培養(yǎng)法分離菌株的鑒定Table 1 Identification of bacteria isolated from Jiaozi

表2 克隆文庫-擴增性rDNA限制酶切法微生物多樣性分析Table 2 Clone-ARDRA analysis of bacteria in Jiaozi

M-DL2000 Marker; H7-空白對照圖1 克隆子PCR擴增產(chǎn)物(A)及ARDRA雙酶切反應(yīng)(B)電泳結(jié)果Fig.1 Clones PCR products(A)and ARDRA(B)

通過ARDRA法鑒定得到的菌種能夠包含所有分離培養(yǎng)的菌種，通過觀察文庫豐度，分離培養(yǎng)得到的5種菌在克隆文庫中所占豐度均較高，豐度總和達95.6%，表明分離培養(yǎng)方法得到了傳統(tǒng)發(fā)酵酵子中最優(yōu)勢菌株。同時，在此次構(gòu)建克隆文庫篩選優(yōu)勢菌群過程中，發(fā)現(xiàn)的微生物種類不是非常多，且未發(fā)現(xiàn)不可培養(yǎng)微生物，這可能與發(fā)酵酵子本身特質(zhì)相關(guān)。一方面酵子在制作完成后一般處在半封閉狀態(tài)，即封存保留以待使用，與外界環(huán)境接觸的機會較少，不會出現(xiàn)制作酵子時再次大規(guī)模引入微生物的情況；另一方面發(fā)酵酵子經(jīng)過不斷的傳代、留種、發(fā)酵[11]，會逐步形成特色的優(yōu)勢微生物——乳酸菌，乳酸菌的大量存在會使酵子的pH值降低，使另一些微生物不適宜生存[12]，這種功能和自然兩方面的選擇壓力促成了優(yōu)質(zhì)傳統(tǒng)發(fā)酵酵子的特點：微生物菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且發(fā)酵能力較強。

實驗結(jié)果顯示，乳酸菌是最優(yōu)勢菌群，Weissella和Lactobacillus兩個屬所占豐度共計占到整個克隆文庫的90%以上，芽孢桿菌、醋酸桿菌及明串珠菌并不是優(yōu)勢菌群，這一結(jié)果與前人對多種傳統(tǒng)發(fā)酵酵子細菌多樣性研究結(jié)果相一致，即乳酸菌為優(yōu)勢菌群，還包括芽孢桿菌、醋酸桿菌等在內(nèi)的多種細菌[13]。但本研究也發(fā)現(xiàn)了“種屬”層面的差異。前人研究結(jié)果中乳酸菌占有優(yōu)勢，但是集中在乳桿菌屬，以發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌、副干酪乳桿菌及舊金山乳桿菌等最為常見[14-17]。1993年COLLIN[18]等結(jié)合傳統(tǒng)表型分型方法和16S rRNA序列測序分析方法，將一些原屬明串珠菌和非典型的異型發(fā)酵乳桿菌，單獨劃為一個簇群，并第一次提出Weissella的名稱，其在微生物學(xué)、發(fā)酵工業(yè)及食品加工等方面的作用近年來開始受到研究者的關(guān)注[19]。本研究中Weissella比乳桿菌屬更具優(yōu)勢，而導(dǎo)致這種“種屬”層面差異的原因可能是酵子的制作原料和環(huán)境。有研究顯示制作饅頭用的酵子的菌種的最初來源可能是面粉、空氣和水[20]，酒曲制作酵子的菌種還會從酒曲中引入[1]，而酒曲中含有豐富的微生物資源[21]。本研究選擇的優(yōu)質(zhì)饅頭發(fā)酵酵子是酒曲曲種添加水和特定的面粉，經(jīng)揉制和發(fā)酵，并通過多次傳代制作而來，故其微生物菌群結(jié)構(gòu)既較單一酵母菌劑豐富，又與一般傳統(tǒng)發(fā)酵酵子有所不同。

2.3 饅頭中揮發(fā)性代謝產(chǎn)物分析

采用傳統(tǒng)發(fā)酵酵子作為發(fā)酵劑制作的饅頭(QJ饅頭)，與市售活性干酵母發(fā)酵劑制作的饅頭(AQ饅頭)在相同的取樣條件和分析條件下進行比較，GC-MS分離鑒定兩種不同菌劑制作饅頭樣品中揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類及相對含量，結(jié)果分別見表3。

表3 饅頭中揮發(fā)性化合物含量Table 3 Concentration of volatile compounds in CSB

續(xù)表3

編號化合物簡稱質(zhì)量濃度(平均值±標準偏差)QJAQ40壬醛Nal1．40±0．17a1．92±0．44a41癸醛Deal1．28±0．32a1．13±0．43a42苯甲醛BALD0．39±0．10and432?壬烯醛Noal0．51±0．15a0．41±0．11a442，4?癸二烯醛Decal0．35±0．11and酯類45反?β?戊酸松油酯PT2．14±0．53and46己酸乙酯HexE8．30±3．14a7．46±0．36b47乙酸己酯AH0．55±0．13a0．86±0．25a48己酸丙酯HP0．10±0．02a0．24±0．08b49庚酸乙酯HeE0．53±0．30a0．77±0．41a502?羥基丙酸乙酯PE0．20±0．08and51己酸丁酯HB1．68±0．41a4．28±1．03a522?甲基?丁酸己酯BHM0．67±0．20a1．48±0．40a53辛酸乙酯OE0．97±0．14a3．56±0．88a54己酸己酯HH0．51±0．15a0．41±0．09a553?苯丙酸?2，3?二氯苯酯PpD0．83±0．21a1．46±0．45a563?苯丙酸?3?氟苯基酯PpF0．91±0．24and574?乙基苯甲酸?2?乙基己酯EE0．21±0．07and58丙酸?2?甲基?3?羥基?2，4，4?三甲基戊基酯PM?HMP4．67±0．97a6．33±2．20a59丙酸?2?甲基?2，2?二甲基?1?(2?羥基?1?甲基乙基)丙酯PMHP3．64±1．09a3．67±0．89a酮類606?甲基?5?庚烯?2?酮HM0．14±0．04and612?(1?環(huán)戊?1?烯?1?甲基乙基)環(huán)戊酮CP0．05±0．02and62(Z)?6，10?二甲基?5，9?十一二烯?2?酮UDZ0．32±0．11and63二氫?5?戊基?2(3H)?呋喃酮FDP0．20±0．04and芳香類641，3，3?三甲基壬基苯BenT0．79±0．11and651，1’?(1，1，2，2?四甲基?1，2?亞乙基)二苯BTE0．77±0．22and66萘Nap0．26±0．10a0．28±0．12a672?甲基萘NapM0．27±0．06a0．32±0．12a68二甲基羥基甲苯BH0．14±0．05and691，2，3，5?四甲基苯B4Mnd0．34±0．07a其他類702?戊基?呋喃FP1．09±0．33a0．40±0．12b

注：平均值±標準偏差(3個重復(fù)的平均值)；nd：未檢測到。

由表3可知，兩種饅頭一共檢測出醇類20種，烴類15種，醛類9種，酯類15種，酮類4種，芳香類6種，其他類1種，共計70種揮發(fā)性成分。烷烴類物質(zhì)屬于高閾值的化合物，對饅頭風(fēng)味貢獻很小[22]。

在饅頭中一共檢測出20種醇類，醇類具有特殊香氣，賦予饅頭香氣作用較大[23]。酯類成分主要來源是酵母和細菌的代謝產(chǎn)物，以及在饅頭蒸制過程中，有機酸和醇類的進一步發(fā)酵的產(chǎn)物(酯化反應(yīng))[24]。其中以己酸乙酯、己酸丁酯等短鏈脂肪酸為主，短鏈脂肪酸是已知的微生物代謝產(chǎn)物，尤其以乳酸菌代謝利用低聚糖后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物為主[25]。本次實驗檢出饅頭中9種醛類和4種酮類揮發(fā)性成分，其中QJ饅頭中9種醛類和4中酮類全部檢出，AQ饅頭沒有檢出酮類成分。醛類和酮類主要由高級醇氧化而來，或在發(fā)酵過程中由酯和氨基酸降解產(chǎn)生，其對饅頭香味的形成有重要的影響[24]。含量最高己醛是一種具有青草氣及蘋果香味的成分[26]。

PCA分析(圖3)顯示PC1與PC2的累積方差貢獻率為77.41 %，其中PC1和PC2的方差貢獻率分別為65.18 %和12.23 %，說明兩個主成分能夠?qū)J饅頭和AQ饅頭進行有效地區(qū)分，其中PC1的貢獻率超過60.00%，說明兩種饅頭的揮發(fā)性成分在PC1上有明顯區(qū)分，結(jié)合圖4和表3分析，QJ饅頭主要在NoneE、Bent、PpF、Pet、PT、HexM、PE、BTE、HepE及HB、BALD、EOB、CP、Hexl等10種醇類、5中醛類、4種酯類和4種酮類成分上與AQ饅頭存在顯著差異。

圖3 饅頭揮發(fā)性成分PCA分析圖Fig.3 PCA analysis of volatile compounds in CSBs

2.4 饅頭中揮發(fā)性成分差異的分析

本次實驗選取的傳統(tǒng)發(fā)酵酵子是饅頭生產(chǎn)企業(yè)進行大規(guī)模饅頭生產(chǎn)使用的酵子，由釀酒所用的酒曲制作而來，其制作的饅頭具有“醇香”特點。本次實驗的主成分分析發(fā)現(xiàn)，在20種醇類、15種酯類、9種醛類和4種酮類當中，QJ饅頭與AQ饅頭的差異主要在10種醇類、5種醛類、4種酯類和4種酮類成分方面。結(jié)合GC-MS定量分析，醇類在總含量上，QJ饅頭(68.08 μg/g)高出AQ饅頭(47.77 μg/g)42.52%，雖然醛類高出116.07%，但醛類總含量(10.89 μg/g)遠低于醇類總含量，所以推測醇類是區(qū)分本次實驗中兩種饅頭的標志物，這符合傳統(tǒng)酵子制作的饅頭“醇香”的感官特征，顯示出除酵母菌種外，豐富的細菌菌種極大地增加了醇類的種類和含量。

其原理主要是小麥面粉中微生物可以利用的碳水化合物首先是淀粉和麥芽糖，其次是蔗糖、葡萄糖和果糖，連同一些三糖，如麥芽三糖和棉子糖[22]。對面團發(fā)酵最關(guān)鍵的酵母菌不能利用面粉中的淀粉、麥芽糖及三糖。結(jié)合表1中微生物菌種發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)發(fā)酵酵子中的食竇魏斯氏菌、融合魏斯氏菌、瑞士乳桿菌等乳酸菌及短小芽孢桿菌能夠代謝麥芽糖等糖類并釋放出葡萄糖、果糖等單糖[27]，短芽孢桿菌還能夠分泌淀粉酶水解淀粉產(chǎn)生單糖[28]。在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的單糖一部分被酵母菌代謝利用，用于細胞增殖，并產(chǎn)生CO2，使面團膨脹；一部分被乳酸菌代謝利用，經(jīng)過同型發(fā)酵和異型發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、醋酸、乙醇、CO2等[27]；同時，蘋果醋桿菌能夠有效利用糖類和酒精產(chǎn)生醋酸[29]。在酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌及醋酸桿菌菌體大量增殖發(fā)酵面團的同時，產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物能夠影響酵子的風(fēng)味和質(zhì)地。

小麥面粉含有蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生多肽和氨基酸，有研究表明乳酸菌對一些非常規(guī)底物(如氨基酸、多肽)的強制性利用也可能產(chǎn)生丙酮酸和乳酸，提高面包的風(fēng)味[30]，同時酵子發(fā)酵過程中乳糖的降解產(chǎn)生醋酸和CO2，也會影響酵子的風(fēng)味和質(zhì)地[31]。

3 結(jié)論

傳統(tǒng)饅頭發(fā)酵酵子是一個豐富的微生物系統(tǒng)，相比較菌種單一的酵母粉，傳統(tǒng)饅頭發(fā)酵酵子中富含的細菌在饅頭醒發(fā)制作過程中能夠產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物[8]，主要表現(xiàn)在醇類的種類更為豐富，含量更高。本研究系統(tǒng)地分析了一種優(yōu)質(zhì)傳統(tǒng)饅頭發(fā)酵酵子中菌群結(jié)構(gòu)特點，獲得了一批菌株資源，這些資源中有些菌株可能具有良好的代謝性能，為下一步篩選合適、優(yōu)異的混合發(fā)酵菌株，構(gòu)建穩(wěn)定、成熟的發(fā)酵體系，進而為傳統(tǒng)發(fā)酵主食的工業(yè)化改進提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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