豉香型白酒制曲原料中肉桂葉游離態(tài)揮發(fā)性成分

何張?zhí)m，范文來*，徐巖，何松貴，劉興益

1(教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇 無錫，214122) 2(廣東省九江酒廠有限公司技術(shù)中心，廣東 佛山，528203)

肉桂葉，為樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的干燥葉，呈橢圓形至近披針形，具有特異香氣，葉柄味較濃。肉桂主要種植于我國南方如廣東、云南、福建等地[1]，是豉香型白酒制曲過程中重要添加物(100 g酒餅中添加約1 g肉桂葉)。添加肉桂葉對酒曲微生物生長繁殖起到一定促進(jìn)作用[2-4]，并影響成品酒的風(fēng)味[5]。

對肉桂揮發(fā)性成分研究多集中于肉桂油，即將肉桂葉或肉桂皮采用水蒸氣蒸餾、超臨界萃取、固相微萃取等方法萃取得到其精油，再結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜儀(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)對精油化學(xué)成分進(jìn)行分析。肉桂精油中含量較多的是肉桂醛(84.22%)、2-甲氧基肉桂醛(7.07%)、香豆素(3.82%)、苯甲醛(1.1%)、乙酸肉桂酯(3.92%)等[6]，然而大量的研究均為半定量[6-10]。

制曲原料中添加的肉桂葉是風(fēng)干后的樹葉，對其揮發(fā)性成分的研究較少。為探索肉桂葉對制曲以及豉香型白酒風(fēng)味的影響，本研究以廣東某豉香型酒廠制曲生產(chǎn)時使用的肉桂葉為原料，采用模擬制曲加水浸泡后，再采用液液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)方法萃取揮發(fā)性成分，結(jié)合GC-MS對其揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定與定量，以期發(fā)現(xiàn)肉桂葉中的重要揮發(fā)性成分，為后續(xù)制曲、釀酒發(fā)酵、蒸餾以及貯存過程的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

肉桂葉樣品：由廣東省九江酒廠有限公司提供。

試劑：無水乙醚、無水氯化鈉、無水硫酸鈉(分析純)，上海國藥集團(tuán)；己酸甲酯(99%，內(nèi)標(biāo))、無水乙醇、表中全定量的化合物(色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-6890N-MSD 5975，美國Agilent公司；N-EVAP111型氮吹儀，美國Organomation公司；5810R離心機(jī)，德國Eppendorf公司；超純水儀，美國Millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 揮發(fā)性化合物提取

[11]的實(shí)驗(yàn)方法。取8 g干燥的肉桂葉，液氮冷卻后立即磨碎，后用150 mL超純水浸泡，室溫、黑暗條件浸泡過夜。過濾，濾液加無水氯化鈉飽和，用60 mL重蒸乙醚液液萃取3次(每次20 mL)，合并有機(jī)相，離心去乳化，取上清液加無水硫酸鈉干燥過夜，氮吹，濃縮至250 μL，進(jìn)行GC-MS分析。

1.3.2 GC-MS條件

色譜柱：FFAP極性柱(60 m×0.25mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：初溫50 ℃，保持2 min，以6 ℃/min升溫至230 ℃，保持45 min；載氣(He)，流速2 mL/min；進(jìn)樣1 μL，不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：離子源230 ℃，EI電離源，電子轟擊能量70 eV，掃描范圍為35～350 amu。

1.3.3 化合物鑒定與定量

揮發(fā)性化合物定性通過質(zhì)譜庫檢索與標(biāo)準(zhǔn)品保留指數(shù)(RI)比對鑒定，沒有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物通過與NIST05a.L數(shù)據(jù)庫(Agilent Technologies Inc.)中標(biāo)準(zhǔn)譜圖以及文獻(xiàn)中報道的保留指數(shù)(RIL)進(jìn)行比對鑒定，其中RI計算方法參考文獻(xiàn)報道[12]。

定量采用液液萃取的前處理方法。過濾后，加入內(nèi)標(biāo)己酸甲酯(終質(zhì)量濃度16.115 mg/L)后進(jìn)行液液萃取，選擇5個不同的批次，每批次測定1次。采用選擇特征離子(SIM)方法定量。

在重蒸后的乙醚溶液中加入待測物標(biāo)準(zhǔn)品的貯備液，進(jìn)行梯度稀釋后，加入內(nèi)標(biāo)己酸甲酯(終質(zhì)量濃度16.115 mg/L)，其他條件同樣品的檢測條件。采用SIM方法計算各化合物峰面積，以各化合物與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度之比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

無標(biāo)準(zhǔn)品半定量化合物質(zhì)量濃度按公式(1)計算：

(1)

式中：C，待測化合物質(zhì)量濃度，μg/g干重；S，待測化

合物峰面積；S內(nèi)，內(nèi)標(biāo)物峰面積；C內(nèi)，內(nèi)標(biāo)化合物終質(zhì)量濃度，μg/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 揮發(fā)性化合物鑒定與定量

經(jīng)GC-MS分析，在肉桂葉水浸提液中檢測到45種揮發(fā)性化合物，包括25種芳香類、8種酚類、6種萜烯類、2種有機(jī)酸類、3種呋喃類以及1種吡喃類，其中31種化合物使用標(biāo)準(zhǔn)品確認(rèn)，14種化合物為臨時性鑒定。與桂葉油早期研究結(jié)果相比[1, 6, 8-9]，新檢測到的成分有苯乙醛、1,2-二甲氧基苯、苯甲醇、己酸、2-甲氧基苯甲醇、愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、丁香醇、氫化肉桂酸內(nèi)酯、苯甲酸、香蘭素、2-甲氧基苯甲酸、2-羥基苯乙醇等。

對肉桂葉樣品中的31種揮發(fā)性成分繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行全定量分析，線性關(guān)系良好，R2范圍在0.904 5～0.999 7，回收率在82%～114%，符合定量要求。

2.2 芳香類化合物

芳香類化合物是肉桂葉中種類最多的、含量最高的游離態(tài)揮發(fā)性化合物，總含量達(dá)6.01 mg/g干重(表1)。共檢測出25種，以芳香醇、芳香醛以及芳香酸為主；首次檢測到的化合物有苯乙醛、1,2-二甲氧基苯、苯甲醇、2-甲氧基苯甲醇、苯甲酸、2-甲氧基苯甲酸、2-羥基苯乙醇等。

表1 肉桂葉中芳香類化合物含量Table 1 The concentrations of aromatic compounds in Cinnamomum cassia Presl leaf

注：a：通過質(zhì)譜定性，臨時性鑒定的化合物，半定量；b：單位為mg/g干重。

芳香醛類主要檢測到苯甲醛、水楊醛、苯乙醛、苯丙醛、反-肉桂醛、2-甲氧基苯甲醛、2-甲氧基肉桂醛(臨時性鑒定)；芳香醇類主要檢測到苯甲醇、2-苯乙醇、肉桂醇、2-羥基苯乙醇、2-甲氧基苯甲醇、α-甲基苯乙醇(臨時性鑒定)、3,5-二甲基苯甲醇(臨時性鑒定)；芳香酸類主要檢測到苯甲酸以及2-甲氧基苯甲酸。大曲揮發(fā)性成分研究結(jié)果表明，在所有香型大曲中，豉香型大曲中總芳香族含量最高[13]。

芳香類化合物中反-肉桂醛含量高達(dá)3.71 mg/g干重，與早期桂葉油研究相比結(jié)果類似[6, 9]；其次是2-苯乙醇，含量為386 μg/g干重。

反-肉桂醛具有典型的肉桂香氣[16]，已經(jīng)在豉香型白酒中檢測到，含量471 μg/L[5]，是豉香型白酒呈香化合物之一，而在其他香型白酒中報道極少。推測豉香型白酒中反-肉桂醛可能來源于制曲原料肉桂葉。研究發(fā)現(xiàn)，在酒餅制作過程中，反-肉桂醛對酒曲微生物繁殖有一定促進(jìn)作用，能誘導(dǎo)釀酒酵母形成，并抑制一些曲霉活性[2-4]。

2-苯乙醇具有典型甜香、玫瑰花香和蜂蜜香[17]，早期桂葉油研究中已經(jīng)檢測到[7, 18]。2-苯乙醇存在于多種香型白酒中，如茅臺酒中含量53.2 mg/L[13]，汾酒30.0 mg/L[12]，老白干 32.9 mg/L[12]，西鳳酒45.0 mg/L[12]，景芝酒中1.18 mg/L[19]，豉香型酒中含量高達(dá)127 mg/L[5]，遠(yuǎn)高于其他香型白酒。推測高濃度2-苯乙醇主要來源：一是釀酒生產(chǎn)過程中L-苯丙氨酸通過埃爾利希途徑(Ehrlich path)生成2-苯乙醇[20]；另外一部分可能來源于曲的遷移。

茴香腦，呈茴香香氣[21]。在早期文獻(xiàn)中曾檢測到[22]，含量4.08 μg/g干重。該物質(zhì)能氧化生成茴香醛[23]，而茴香醛在藥香型白酒中已經(jīng)檢測到[21]，推測白酒中的茴香醛很有可能是原料桂葉中的茴香腦經(jīng)發(fā)酵、蒸餾過程中的氧化形成。

2.3 酚類化合物

在肉桂葉中共檢測到8種酚類化合物(表 2)，包括首次檢測到的愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、丁香醇、香蘭素、丁香醛。

酚類化合物總含量達(dá)到402 μg/g干重，其中含量最高的為首次檢測到的丁香醛(176 μg/g干重)，其次為丁香醇(57.3μg/g干重)與丁香酚(56.8 μg/g干重)。丁香酚已經(jīng)在桂葉油中檢測到，其含量占肉桂油的0.677%[8]。

酚類化合物大多數(shù)具有煙熏味，如愈創(chuàng)木酚、丁香醇等。而香蘭素則賦予肉桂葉香草氣味[11]。

表2 肉桂葉中酚類化合物含量Table 2 The concentrations of phenolic compounds of Cinnamomum cassia Presl leaf

注：a：臨時性鑒定的化合物，半定量方法定量，通過質(zhì)譜定性。

2.4 萜烯類化合物

從肉桂葉中共檢測到6種萜烯類化合物(表 3)，總含量57.9 μg/g干重，包括2-茨醇與β-紫羅蘭酮(臨時性鑒定)及其衍生物(臨時性鑒定)。萜烯類化合物廣泛存在于植物中，這類化合物具有抗癌癥、抗病毒以及抗炎癥等作用[14]。

2-茨醇，又稱龍腦，呈樟腦、墨水香氣[17]；在肉桂葉中含量為5.52μg/g干重，在桂葉油中含量0.134%[8]。

2.5 其他化合物

從肉桂葉中還檢測到2種有機(jī)酸化合物、3種呋喃類化合物以及1種吡喃類化合物(表4)。其中己酸、氫化肉桂酸內(nèi)酯均為首次檢測到的揮發(fā)性化合物[1, 6, 8-9]。

2種有機(jī)酸類化合物包括乙酸和己酸，總含量38.7 μg/g干重，在早期肉桂油的研究中曾檢測到乙酸[9]。

3種呋喃類化合物包括2,3-二氫苯并呋喃以及氫化肉桂酸內(nèi)酯以及2-甲基苯并呋喃(臨時性鑒定)。

1個吡喃類化合物為香豆素。香豆素含量達(dá)到2.60 mg/g 干重，是本研究中檢測到含量僅次于反-肉桂醛的游離態(tài)揮發(fā)性化合物。香豆素存在于桂葉油中[6]。該化合物具有甜香、椰子香的風(fēng)味特征[17]。

表3 肉桂葉中萜烯類化合物含量Table 3 The concentrations of terpenes of Cinnmaomum cassia Presl leaf

注：a：臨時性鑒定的化合物，半定量方法定量，通過質(zhì)譜定性；

表4 肉桂葉中其他化合物含量Table 4 The concentrations of other compounds of Cinnmaomum cassia Presl leaf

注：a：臨時性鑒定的化合物，半定量，通過質(zhì)譜定性；b：單位為mg/g干重。

3 結(jié)論

肉桂葉采用水溶液浸泡，LLE方法萃取揮發(fā)性成分，經(jīng)GC-MS分析共檢測出45種揮發(fā)性化合物，包括25種芳香類、8種酚類、6種萜烯類、2種有機(jī)酸類、3種呋喃類以及1種吡喃類，首次檢測到化合物有苯乙醛、1,2-二甲氧基苯、苯甲醇、己酸、2-甲氧基苯甲醇、愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、丁香醇、氫化肉桂酸內(nèi)酯、苯甲酸、香蘭素、2-甲氧基苯甲酸、2-羥基苯乙醇等。芳香族化合物在肉桂葉中種類最多，含量較高。肉桂葉中含量最高的化合物是反-肉桂醛(mg/g以上)，接著是香豆素(mg/g以上)，再次是μg/g級的2-苯乙醇、丁香醛、氫化肉桂酸內(nèi)酯、苯甲醛等。推測反-肉桂醛是肉桂葉的主要香氣成分，并為豉香型白酒提供重要香氣。

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