基于亞臨界水技術的魚骨軟化及其在魚糜中的應用

沙小梅，郝君暉，涂宗財,*，胡姿姿，王振興，張露，李鑫，王輝，黃濤

1(江西師范大學 功能有機小分子教育部重點實驗室&生命科學學院，江西 南昌，330022) 2(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌，330047)

我國淡水魚資源豐富，是世界淡水魚生產大國，淡水魚養(yǎng)殖量居于世界第一。據統(tǒng)計，2015年我國淡水魚養(yǎng)殖產量為2 715.01萬t，比2014年增加112.04萬t，增長4.30%[1]。除鮮銷外，淡水魚主要用于加工，形成各式各樣的魚類加工制品。魚骨是魚類加工業(yè)的副產物之一，含有脂肪、蛋白、鈣、磷等多種營養(yǎng)成分[2]，魚骨中富含鈣質，且鈣、磷比例合理，易于被人體吸收[3]，將其添加食品中，可以增加食品的營養(yǎng)價值[4]。但魚骨十分堅硬，如果將其直接加入食品，不僅會對食品的口感產生一定影響[5]，且其中的營養(yǎng)物質也不能完全被人體吸收利用。目前，對于魚骨的處理手段逐漸多樣化，包括高壓脈沖電場法[6]、酶法[7-8]和球磨法[9-10]等。

亞臨界水為在100～374 ℃之間、在外加壓力的條件下仍然保持液態(tài)的水[11]。亞臨界水擁有較高的離子積，較低的相對介電常數，黏度和表面張力，從而有利于物質的提取[12]。目前，亞臨界水技術較多地用于天然產物的提取[13-15]，同時也在植物精油提取[16]、污泥處理[17]、食品檢測[18]和蛋白質改性[19]等多個方面都有應用。亞臨界水作為一種特殊的加壓壓縮流體溶劑，具有環(huán)保、無毒及費用低的優(yōu)點[20]。若能將亞臨界水用于魚骨的軟化處理，將有效提高魚骨的可利用性，增強魚骨中營養(yǎng)物質的釋放程度。

魚糜是一種現代新型的魚類加工制品，具有高蛋白、低脂肪、方便快捷等優(yōu)點[21]。將魚骨添加至魚糜中，可進一步提高魚糜制品的營養(yǎng)價值。因此，本文以醋酸溶液為媒介，采用亞臨界水技術的低溫段處理魚骨，以期達到軟化魚骨和保留其營養(yǎng)價值的雙重目的。然后將軟化后的魚骨加入魚糜制成魚糜凝膠，對比分析軟化后魚骨對魚糜凝膠性能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鰱魚，市售；其他試劑均為分析純。

YXQ-LS-100SII立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；BioTek Synergy H1 全功能酶標儀，美國BioTek儀器有限公司；Centrifuge 5430 R 多功能微型臺式高速離心機，艾本德(上海)實驗室科技有限公司；Easy系列超純水系統(tǒng)，上海領德儀器有限公司；柯尼卡美能達CR-13色度儀，日本柯尼卡美能達控股公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚骨的處理和成分測定

鰱魚宰殺后，經過去鱗、去頭和去內臟處理，切成2片后再進行采肉機處理即分別得到魚肉和下腳料，將下腳料中的魚骨挑選出來，沸水煮1 min后撈出，剔除魚骨上剩余的魚肉和膜性組織，用蒸餾水沖洗，放入37 ℃的烘箱中烘12 h，用自封袋封好放入-20 ℃冰箱中備用。參照國家標準對魚骨中的水分、灰分、粗蛋白、和粗脂肪的含量進行測定。

1.2.2 亞臨界水技術結合醋酸軟化魚骨

1.2.2.1 亞臨界水溫度對魚骨軟化效果的影響

研究亞臨界水溫度對魚骨軟化效果的影響，分別將亞臨界水溫度設置為100、108、116、124、132 ℃，處理時間為1 h，醋酸濃度為0.5 mol/L，料液比為1∶20(g∶mL)，結束后測定溶液中鈣溶出量和游離氨基含量。

1.2.2.2 亞臨界水處理時間對魚骨軟化效果的影響

研究不同亞臨界水處理時間對魚骨軟化效果的影響，亞臨界水的處理時間分別設置為0、0.5、1.0、1.5、2.0 h，亞臨界水溫度為116 ℃，醋酸濃度為0.5 mol/L，料液比為1∶20(g∶mL)，結束后測定溶液中鈣溶出量和游離氨基含量。

1.2.2.3 醋酸濃度對魚骨軟化效果的影響

研究醋酸濃度對亞臨界水軟化魚骨效果的影響，醋酸濃度分別設為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mol/L，料液比為1∶20(g∶mL)，亞臨界水處理溫度為116 ℃，處理時間為1 h，結束后測定溶液中鈣溶出量和游離氨基含量。

1.2.2.4 料液比對魚骨軟化效果的影響

研究不同料液比對亞臨界水軟化魚骨效果的影響，分別以1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g∶mL)的料液比將魚骨與水混合，醋酸濃度為0.5 mol/L，亞臨界水處理溫度為116 ℃，處理時間為1 h，結束后測定溶液中鈣溶出量和游離氨基含量。

1.2.3 樣品中鈣溶出量的測定

用蒸餾水將待測溶液稀釋一定倍數，加入3 mL三乙醇胺和5 mL氨性溶液，然后滴入2滴鉻黑T指示劑，然后以0.02 mol/L的EDTA標準溶液滴定，酒紅色變成藍色即為終點，根據標準回歸方程求解溶液中的鈣含量，平行測量3次。標準回歸方程是基于以CaCl2為標準物繪制的標準曲線求得。

1.2.4樣品中游離氨基含量的測定

采用OPA法測定反應產物中自由氨基的含量。配制OPA試劑，此試劑要現配現用。準確稱取40.0 mg的OPA溶解于1.0 mL甲醇中，再加入0.2 g/mL的十二烷基硫酸鈉(SDS)2.5 mL，硼砂(0.1 mol/L) 25.0 mL，β-巰基乙醇100 μL最后用蒸餾水定容到 50 mL。

測定時，取1.0 mL OPA試劑于試管中，加入50 μL樣品，混合均勻，放入35 ℃水浴中反應2 min后在340 nm下測吸光值A340，另取1.0 mL OPA試劑于試管中，加入50 μL水作為空白對照。

用相同的方法，以亮氨酸代替樣品作出標準曲線，根據曲線計算樣品中游離氨基的含量。

1.2.5 魚糜相關參數測定

1.2.5.1 魚糜凝膠的制備

將最佳條件下蒸煮的魚骨打碎，進行旋蒸濃縮。向魚糜中加入濃縮后的魚骨和湯汁，調節(jié)魚糜含水量至78%，同時，向另一組魚糜中加入純水調節(jié)其含水量作為對照組。置于90 ℃的水浴中加熱30 min，加熱后立即置于冰水中冷卻至室溫，4 ℃放置12 h，待測。

1.2.5.2 凝膠強度的測定

將制備好的魚腸從4 ℃取出，室溫放置，使魚腸溫度平衡至室溫，然后將其切成厚25 mm的片段，破斷強度和凹陷度直接采用質構儀測定。采用直徑為5 mm的探頭，以60 mm/min 的速度穿刺樣品至20 mm，穿刺曲線上的第1個峰為破斷強度，對應的距離為凹陷度。其中破斷強度反映魚糜凝膠的硬度，凹陷度反映魚糜凝膠的彈性。二者的乘積為凝膠強度，即：

凝膠強度/(N·mm)=破斷強度(N)×凹陷度(mm)

(1)

每組試驗重復3次，試驗結果為3次測定結果的平均值[22]。

1.2.5.3 白度的測定

參考陳海華等人[23]的方法，將樣品切成厚3 mm的薄片，室溫下用色差計測定樣品的色澤，儀器采用標準白板校正，記錄L、a、b表示顏色的坐標，L表示樣品的亮度，+a表示樣品偏紅，-a表示樣品偏綠：+b表示樣品偏黃，-b表示樣品偏藍。白度W按公式(2)計算：

(2)

每組試驗重復3次，試驗結果為3次測定結果的平均值。

1.2.5.4 持水性能的測定

參考王雨生等[24]的方法，將樣品切成厚3 mm的薄片并稱質量(m1)，下面放3張濾紙，上面放2張濾紙，用5 kg的重物壓制并保持2 min，去掉濾紙，再將樣品稱質量(m2)，失水率按公式(3)計算：

(3)

每組試驗重復3次，試驗結果為3次測定結果的平均值。

1.2.6 數據的統(tǒng)計學分析

所有實驗數據都是來源于3個平行樣測得的結果取平均值，數據通過SPSS 22.0進行分析，選取Duncan’s test用于顯著性分析(p<0.05)。

2 結果與分析

2.1 魚骨成分組成

魚骨的成分組成如表1所示。從表1中可以看出，烘干后鰱魚魚骨的基本組成成分中，以灰分的含量最高，約為53.85%；其次為蛋白質，約為29.8%；而脂肪和水分含量分別約為8.69%和7.91%。測定結果與馬國紅等[2]的結果基本相一致。

表1 魚骨的成分組成 單位：%

2.2 亞臨界水技術結合醋酸軟化魚骨的效果分析

2.2.1 亞臨界水溫度對魚骨軟化效果的影響

亞臨界水溫度對魚骨軟化后每克魚骨中鈣溶出量和游離氨基含量的影響如圖1所示。

圖1 亞臨界水溫度對魚骨軟化中鈣溶出量(A)和游離氨基含量(B)的影響Fig.1 The effect of temperature of sub-critical water on calcium content(A)and free amino acid content(B)

圖1-A可知，魚骨軟化后鈣溶出量隨亞臨界水溫度的升高而逐漸升高，當溫度達到116 ℃時趨于平緩。引起此現象的原因可能是當亞臨界水的溫度升高，在醋酸的作用下，魚骨中羥基磷灰石分解速度加快，導致溶液中鈣離子溶出量增多。當亞臨界水溫度增加到一定程度(116 ℃)時，魚骨中的鈣溶出量達到最大，所以即使溫度進一步升高，魚骨的鈣溶出量也不會再發(fā)生變化。

由圖1-B可知，魚骨軟化后溶液中游離氨基含量隨亞臨界水溫度的升高而呈現遞增的趨勢，出現這種現象的原因可能是隨著溫度的升高，魚骨中的羥基磷灰石等礦物質逐漸溶出，從而使蛋白質分子擺脫其束縛。在高溫和醋酸的共同作用下，蛋白質分子被打斷，因此游離氨基含量增加。

綜合亞臨界水溫度對魚骨軟化后鈣溶出量和游離氨基含量的影響效果，選取亞臨界水溫度為124 ℃，此條件下，魚骨軟化后鈣和游離氨基的溶出量均比較高，且溫度不至于過高而浪費資源和過度水解蛋白質。

2.2.2 亞臨界水處理時間對魚骨軟化效果的影響

亞臨界水處理時間對魚骨軟化后每克魚骨中鈣溶出量和游離氨基含量的影響如圖2所示。

圖2 亞臨界水處理時間對魚骨軟化中鈣溶出量(A)和游離氨基含量(B)的影響Fig.2 The effect of reaction time of sub-critical water on calcium content(A)and free amino acid content(B)

由圖2-A可知，魚骨軟化后鈣溶出量隨亞臨界水處理時間的延長而升高，當處理時間達到1.0 h時趨于平緩，說明亞臨界水處理時間的增加能夠增加魚骨中的鈣離子溶出，且在處理時間達到1.0 h時達到最大。

由圖2-B可知，魚骨軟化后溶液中游離氨基的含量隨亞臨界水溫度的升高而逐漸升高，在處理時間達到1.5 h時趨于平穩(wěn)。這種現象發(fā)生的原因可能是隨著處理時間的增長，魚骨中的蛋白質分子不斷被打斷，從而使游離氨基的含量不斷增加。

綜合亞臨界水處理時間對魚骨軟化后鈣溶出量和游離氨基含量的影響效果，選取亞臨界水的處理時間為1.5 h。此條件下，魚骨軟化后鈣和游離氨基的溶出量均達到最高，魚骨軟化效果好。

2.2.3 醋酸濃度對魚骨軟化效果的影響

醋酸濃度對魚骨軟化后每克魚骨中鈣溶出量和游離氨基含量的影響如圖3所示。

圖3 醋酸濃度對魚骨軟化中鈣溶出量(A)和游離氨基含量(B)的影響Fig.3 The effect of acetic acid concentration of sub-critical water on calcium content(A)and free amino acid content(B)

由圖3-A可知，魚骨軟化后鈣溶出量隨著醋酸濃度的升高而逐漸增加，這是因為隨著醋酸濃度的升高，魚骨中的鈣逐漸轉化為醋酸鈣的量逐漸增多，醋酸鈣溶于水中，從而導致鈣的溶出量不斷增高。

由圖3-B可知，魚骨軟化后游離氨基的溶出量隨著醋酸濃度的升高而升高，當醋酸濃度達到0.7 mol/L時，游離氨基溶出量趨于平穩(wěn)。出現這種現象的原因可能是高濃度的醋酸能夠促進蛋白質分子被打斷從而游離氨基含量增加。在一定條件下，當游離氨基的含量達到一定程度時，即使繼續(xù)提高醋酸濃度，游離氨基的含量變化也不明顯。

綜合醋酸濃度對魚骨軟化后鈣溶出量和游離氨基含量的影響效果，選取醋酸濃度為0.9 mol/L。此條件下，魚骨軟化后鈣和游離氨基的溶出量均達到最高，魚骨軟化效果好。

2.2.4 料液比對魚骨軟化效果的影響

料液比對魚骨軟化后每克魚骨中鈣溶出量和游離氨基含量的影響如圖4所示。

圖4 料液比對魚骨軟化中鈣溶出量(A)和游離氨基含量(B)的影響Fig.4 The effect of solid-liquid ratio of sub-critical water on calcium content(A)and free amino acid content(B)

由圖4-A可知，隨著料液比的減小，魚骨軟化后鈣溶出量逐漸升高。出現這種現象的原因可能是料液比減小，體系中醋酸的量增加，使魚骨中的鈣能夠大量轉化為醋酸鈣，從而增加了魚骨中鈣離子的溶出。

由圖4-B可知，隨著體系中醋酸量的增多，魚骨軟化后游離氨基的含量隨之升高，這是因為醋酸量的增加能夠更大幅度地使魚骨中的鈣溶出，從而使魚骨中的蛋白質分子擺脫束縛，且醋酸量的增加能夠加速破壞蛋白質分子，致使游離氨基含量增加。

綜合料液比對魚骨軟化后鈣溶出量和游離氨基含量的影響效果，以及實際生產中的成本問題，選取料液比為1∶25。此條件下，魚骨軟化后鈣離子和游離氨基的溶出量均較高，魚骨軟化效果較好，且醋酸量不至于太大，在實際生產中能夠節(jié)約成本。

2.3 魚骨軟化最佳工藝的確定

本文以魚骨軟化后鈣溶出量和游離氨基含量作為評價指標，研究了亞臨界水的溫度、處理時間、醋酸濃度和料液比4個單因素對魚骨軟化效果的影響。通過一系列試驗指標的測定，結合實驗結果和生產過程中的成本問題，最終確定了魚骨軟化的最佳工藝，即亞臨界水溫度124 ℃，處理時間1.5 h，醋酸濃度為0.9 mol/mL，料液比為1∶25，此時鈣溶出量和游離氨基含量最大，如表2所示。

表2 最佳條件下魚骨軟化的相關參數Table 2 The correlation parameter of fish bones treatedwith optimum condition

尹濤[9]分別利用干法球磨和高能濕法球磨的方法對魚骨進行細化處理，研究了適宜的工藝條件。周亞軍等[6]利用高壓脈沖電場輔助提取魚骨中的鈣，確定了魚骨鈣提取的最佳工藝。余海霞等[7]利用酶解和超微粉碎技術從魚骨中制備超微鈣粉。上述研究均進行了魚骨細化的預處理，而本文則以醋酸溶液為媒介，利用亞臨界水技術直接對魚骨進行軟化處理，借助醋酸和亞臨界水的雙重作用使魚骨中的羥基磷灰石快速形成鈣離子溶于溶液中，并使蛋白質的肽鍵在一定程度上發(fā)生斷裂，進而提高魚骨的可利用率，具有高效率、低耗時等優(yōu)點。

2.4 高鈣魚糜凝膠相關參數

2.4.1 高鈣魚糜凝膠的白度測定

魚糜凝膠白度的測定結果見表3。

表3 魚糜凝膠的相關參數Table 3 The whiteness of surimi gel

添加軟化后的魚骨能夠影響魚糜的白度，結果顯示，添加軟化魚骨的魚糜凝膠與對照組魚糜凝膠相比白度降低，樣品偏黃。這是因為在亞臨界水處理過程中，魚骨上殘留的膜性組織等會使魚骨液顏色變黃，將這種軟化魚骨添加進入魚糜后導致魚糜凝膠白度降低。

2.4.2 高鈣魚糜凝膠的持水性測定

魚糜凝膠失水率的測定結果見表3。添加軟化魚骨后的魚糜凝膠與對照組魚糜凝膠相比失水率顯著降低，持水性能顯著提高。說明加入軟化后的魚骨能夠使魚糜形成更加致密、均勻的凝膠網格結構，從而將水分有效地保留在其中，因此失水率降低。

2.4.3 高鈣魚糜的凝膠強度測定

魚糜凝膠強度的測定結見如表3。添加軟化魚骨后的魚糜凝膠強度與對照組魚糜的凝膠強度差別不大，說明加入軟化后的魚骨對于魚糜的凝膠強度沒有太大影響。尹濤[9]的研究結果表明，魚骨中的鈣離子能增強魚糜中內源性谷氨酰胺轉氨酶的活力，形成更多的ε-(γ-谷氨酸)賴氨酸交聯(lián)而增強魚糜凝膠的凝膠強度。本文中，魚骨與魚糜混勻后立即置于90 ℃的水浴中加熱30 min，未進行一段時間的低溫凝膠化處理，使得內源性谷氨酰胺轉氨酶的交聯(lián)作用難以發(fā)揮，因此魚骨的添加對魚糜凝膠強度改變不明顯。

3 結論

本文利用亞臨界水技術結合醋酸對魚骨進行軟化，根據魚骨中鈣溶出量、游離氨基含量和實際生產成本問題，確定魚骨軟化的最佳條件為：亞臨界水溫度124 ℃，亞臨界水處理時間1.5 h，醋酸濃度0.9 mol/L，料液比1∶25(g∶mL)。此條件下，每克魚骨的鈣溶出量為102.50 mg，游離氨基含量為16.01 mg。將軟化后的魚骨加入魚糜中，能顯著提高魚糜凝膠的持水性，對魚糜凝膠強度沒有明顯改變，但是會降低魚糜凝膠的白度。

魚骨軟化作為魚類加工副產物利用的一種方式能夠將魚骨變廢為寶，在節(jié)約資源的基礎上，減少廢棄物對環(huán)境的污染。經過最佳工藝軟化的魚骨添加進入食品，能夠增加食品中易于被人體吸收的鈣質，豐富其營養(yǎng)成分，在今后的食品加工行業(yè)具有廣闊的市場和前景。

[1] 農業(yè)部漁業(yè)局編制. 中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒(2016)[M]. 北京：中國農業(yè)出版社, 2016.

[2] 馬國紅, 張延華, 王愛英, 等. 幾種常見魚類魚鱗、魚骨成分分析[J]. 山東師范大學學報：自然科學版, 2013, 28(4): 137-139.

[3] 王建輝, 劉冬敏, 劉永樂, 等. 淡水魚魚骨軟化工藝條件的優(yōu)化[J]. 食品與機械, 2011, 27(2): 109-111.

[4] DARMANTO Y S, AGUSTINI T W, SWASTAWATI F, et al. The effect of fish bone collagens in improving food quality.[J]. International Food Research Journal, 2014, 21(3): 891-896.

[5] YIN T, REED Z H, PARK J W. Gelling properties of surimi as affected by the particle size of fish bone[J]. LWT-Food Science and Technology, 2014,58(2):412-416.

[6] 周亞軍, 隋思瑤, 黃卉, 等. 高壓脈沖電場輔助提取魚骨鈣工藝優(yōu)化[J]. 農業(yè)工程學報, 2012, 28(23): 265-270.

[7] 余海霞, 余娟, 黃鶴勇, 等. 酶法制備鮟鱇魚骨超微鈣粉的研究[J]. 水產學報, 2012, 36(12): 1 917-1 923.

[8] 洪惠, 羅永康, 呂元萌, 等. 酶法制備魚骨膠原多肽螯合鈣的研究[J]. 中國農業(yè)大學學報, 2012, 17(1): 149-155.

[9] 尹濤. 納米魚骨的制備、特性表征及其對魚糜膠凝影響的機制研究[D]. 武漢：華中農業(yè)大學, 2015.

[10] ZHANG J, YIN T, XIONG S, et al. Thermal treatments affect breakage kinetics and calcium release of fish bone particles during high-energy wet ball milling[J]. Journal of Food Engineering, 2016,183:74-80.

[11] MARCET I,LVAREZ C, PAREDES B, et al. The use of sub-critical water hydrolysis for the recovery of peptides and free amino acids from food processing wastes. Review of sources and main parameters[J]. Waste Management, 2016,49:364.

[12] 王榮春, 盧衛(wèi)紅, 馬鶯. 亞臨界水的特性及其技術應用[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(8): 373-377.

[13] 丁蕓, 李海姝, 劉玉梅. 核桃青皮活性成分的亞臨界水提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性[J]. 中國釀造, 2016, 35(5): 75-80.

[14] 祁英. 亞臨界水技術研究天山雪菊的活性成分[D]. 烏魯木齊：新疆大學, 2014.

[15] 楊文雅, 李長征, 張海暉, 等. 蛹蟲草多糖的亞臨界水萃取及其抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2016, 37(5): 252-257.

[16] 應麗亞, 蘇平. 亞臨界水萃取技術在植物精油提取中的應用潛力[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2011, 37(5): 142-145.

[17] 阮辰旼, 吳曉暉. 亞臨界水處理技術處理污泥效果的初步試驗[J]. 給水排水, 2012(s2): 30-32..

[18] 王嘯, 林翠萍, 張燕. 亞臨界水-固相萃取有機磷殘留前處理技術[J]. 食品研究與開發(fā), 2013(12): 73-75.

[19] 鈕培佩. 亞臨界水技術對蛋清蛋白的改性研究及高起泡性能蛋白粉的研制[D]. 南昌：南昌大學, 2015.

[20] 張曉倩, 王榮春, 馬鶯, 等. 亞臨界水技術及其在天然產物提取中的應用[J]. 食品研究與開發(fā), 2015, (11): 132-136.

[21] 秦影, 歐昌榮, 湯海青, 等. 魚糜制品凝膠特性研究進展[J]. 核農學報, 2015, 29(9): 1 766-1 773.

[22] KONG W, ZHANG T, FENG D, et al. Effects of modified starches on the gel properties of Alaska Pollock surimi subjected to different temperature treatments[J]. Food Hydrocolloids, 2015,56(1):20-28.

[23] 陳海華, 薛長湖. 熱處理條件對竹莢魚魚糜凝膠特性的影響[J]. 食品科學, 2010, 31(1): 6-13.

[24] 王雨生, 陳海華. 凝膠化時間和卵清蛋白添加量對竹莢魚魚糜凝膠特性的影響[J]. 食品科學, 2013, 34(3): 64-69.