pH和NaCl質(zhì)量濃度對發(fā)酵魚糜中腐敗菌Aeromonas veronii bv.veronii群體感應(yīng)的影響

趙丹丹，劉琳，王迪，呂飛，丁玉庭，陳文烜，周緒霞*

1(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品科學(xué)研究所，浙江 杭州，310021)2(浙江工業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 杭州，310014)

微生物引起的食品腐敗變質(zhì)是在基因水平受到群體感應(yīng)(Quorum sensing，QS)調(diào)控的一種依賴菌體濃度發(fā)生的現(xiàn)象[1-3]。細(xì)菌通過QS系統(tǒng)來調(diào)控自身一些生理機能的表達，如生物膜的形成、鞭毛運動等毒力因子的表達，從而提高細(xì)菌的致病性以及在食品中的致腐性[4]。目前革蘭氏陰性菌的QS系統(tǒng)主要是由N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-acyl homoserine lactone，AHL)類信號分子調(diào)控。

氣單胞菌是食品中常見的腐敗菌[5-6]，可通過產(chǎn)生胞外酶、生物膜、腸毒素和溶血素等引起食品腐敗變質(zhì)，降低食品安全性[7-8]。本實驗室在前期研究過程中開發(fā)了一種可以將魚糜高值化利用的真菌發(fā)酵技術(shù)[9]，并在發(fā)酵魚糜中篩選到了1株具有較強致腐能力的腐敗菌，Aeromonasveroniibv.veronii。在研究過程中發(fā)現(xiàn)，A.veroniibv.veronii具有AHLs介導(dǎo)的QS系統(tǒng)，且其QS系統(tǒng)表達在培養(yǎng)過程中受環(huán)境變化發(fā)生改變。由此推測食物基質(zhì)中存在的化合物和儲藏環(huán)境會影響細(xì)菌的QS系統(tǒng)的表達[10]，且會進一步影響細(xì)菌的致腐性與致病性，因此研究環(huán)境因素對腐敗菌的QS及相關(guān)代謝行為的影響對水產(chǎn)品的品質(zhì)控制具有重要意義。目前僅有外國學(xué)者研究了培養(yǎng)條件對Aeromonashydrophila的QS系統(tǒng)的影響[10-11]，關(guān)于A.veroniibv.veronii的QS相關(guān)研究還未有報道。

本項目主要以發(fā)酵魚糜中的腐敗菌A.veroniibv.veronii為研究對象，研究環(huán)境因素(pH、NaCl質(zhì)量濃度)對細(xì)菌A.veroniibv.veronii產(chǎn)AHLs活性、生物膜的形成及泳動能力的影響。該研究將加深對氣單胞菌的QS現(xiàn)象的理解，為通過調(diào)控QS降低細(xì)菌毒性進而防止食品腐敗的新策略提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

菌種：A.veroniibv.veronii，分離于發(fā)酵魚糜；根癌農(nóng)桿菌AgrobacteriumtumefaeiensA136(pCF218/PCF372)，壯觀霉素抗性，用量為50 μg/mL。所有菌種添加20%甘油保存于本實驗室-80 ℃冰箱中。

試劑：鹽酸、氯化鈉、碳酸鈉、甲酸、乙酸乙酯、三氯甲烷等為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醇等為色譜純，阿拉丁試劑(上海)有限公司；營養(yǎng)肉湯(NB)、NB固體培養(yǎng)基、瓊脂粉等，青島海博生物技術(shù)有限公司；壯觀霉素、X-gal、鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷(oNPG)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、β-巰基乙醇、Z-buffer、結(jié)晶紫，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C型數(shù)顯酸度計，上海精科儀器有限公司；YXQ-LS-SⅡ立式壓力蒸汽滅菌鍋，SW-CT-4D潔凈工作臺，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海恒科學(xué)儀器有限公司；CR21GⅡ高速離心機，日本Hitachi公司；FV300激光共聚焦顯微鏡，日本OLYMPUS；SPECTRAmax M5酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司； StepOne型熒光定量PCR儀，美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 pH值對細(xì)菌菌落總數(shù)和AHLs活性的影響

首先配制不同pH值(6.0、7.0、8.0)的NB液體培養(yǎng)基(含5 g/L NaCl)。將待測菌過夜活化12 h，利用生理鹽水制備菌懸液，接種于不同pH值的100 mL NB培養(yǎng)基中，終濃度為1×103CFU/mL。30 ℃搖床培養(yǎng)18 h至細(xì)菌達生長穩(wěn)定期，測定培養(yǎng)液中細(xì)菌的菌落總數(shù)及產(chǎn)生的AHLs活性。培養(yǎng)基的pH值用1 mol/L HCl溶液進行調(diào)節(jié)。

1.3.2 NaCl質(zhì)量濃度對細(xì)菌菌落總數(shù)和AHLs活性的影響

首先配制不同NaCl質(zhì)量濃度的(5、10、20 g/L)的NB液體培養(yǎng)基，且各培養(yǎng)基pH固定為7.0。將待測菌活化12 h，利用生理鹽水制備菌懸液，接種于不同含鹽量的100 mL NB培養(yǎng)基中，終濃度為1×103CFU/mL。30 ℃搖床培養(yǎng)18 h至細(xì)菌達生長穩(wěn)定期，測定培養(yǎng)液中細(xì)菌的菌落總數(shù)及產(chǎn)生的AHLs活性。

1.3.3 菌落總數(shù)的測定

按照GB/T 4789.2—2008的方法計數(shù)。

1.3.4 AHLs的活性測定

A.veroniibv.veroni在不同條件下的AHLs活性通過監(jiān)測報告菌根癌農(nóng)桿菌的β-半乳糖苷酶活性來反映。待測菌的β-半乳糖酶活性參照PONNUSAMY等[12]的方法來測定。將報告菌A.tumefaciensA 136 活化12 h后，用NB液體培養(yǎng)基按一定比例稀釋至1×103CFU/mL，加入200 μL待測菌的培養(yǎng)上清液，培養(yǎng)至OD600≈0.6左右，記錄OD600。另取5 mL離心管，依次加入800 μL Z-buffer、200 μL培養(yǎng)12 h的菌液、100 μL 0.1%SDS、150 μL三氯甲烷，充分振蕩，加入100 μL的4 mg/mLoNPG，充分振蕩，置于28 ℃的水浴中，待溶液變黃之后，加入600 μL的1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，記錄反應(yīng)時間。將反應(yīng)液離心(10 000 r/min，5min)，測OD420。根據(jù)變色時間，OD420和OD600計算β-半乳糖苷酶的活性。每個處理設(shè)3個重復(fù)，以NB培養(yǎng)基做陰性對照。酶活力單位定義為：在所在條件下，每分鐘分解1 moloNPG所需要的量為1個酶活力單位。計算公式為：酶活力=(1000×OD420)/(OD600×T×0.2 mL)，其中T為添加菌液的體積反應(yīng)時間，單位為min。

(1)

1.3.5 生物膜形成能力的測定

參照PACKIAVATHY等[14]的方法，利用激光共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscope，CLSM)技術(shù)觀察待測菌的生物膜在不同培養(yǎng)條件下的結(jié)構(gòu)變化。取1 mL不同pH值(6.0、8.0)和不同含鹽量(5、20 g/L)的NB培養(yǎng)基,加入24孔板中，同時將待測菌的生理鹽水菌懸液，按1∶1 000的比例稀釋，加入直徑為1 cm的圓形蓋玻片30 ℃靜置培養(yǎng)24 h。將蓋玻片取出，用無菌水輕輕沖洗玻片上未粘附的細(xì)胞，用0.1%吖啶橙染色1 min。洗去多余的染色液，將蓋玻片置于CLSM下觀察，該顯微鏡裝有激發(fā)波長為515～560 nm的激發(fā)濾光器及60×(60倍)的油鏡，其熒光顯微鏡照片與光鏡照片均由Fluoview v5.0軟件獲得。

1.3.6 泳動能力的測定

參照PACKIAVATHY等[14]的方法，并稍作改動。首先制備不同pH值(6.0、7.0、8.0)和不同含鹽量(5、10、20 g/L)的NB固體培養(yǎng)基(含0.3%瓊脂)，滅菌后冷卻至50 ℃時倒平板，待凝。將待測菌活化12 h后，取1.5 μL細(xì)菌培養(yǎng)液分別點樣在含不同NB平板上，以無菌生理鹽水為對照，將平板置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌體變化拍照并測量菌落直徑。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

運用SPSS 21.0 軟件和Origin 8.5 軟件進行數(shù)據(jù)分析。測定結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n≥3)表示，采用最小顯著差異法(LSD)進行顯著性差異分析，顯著性水平為5%。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對A. veronii bv. veronii QS系統(tǒng)的影響

2.1.1 對菌落總數(shù)和產(chǎn)AHLs活性的影響

pH對A.veroniibv.veronii的菌落總數(shù)、產(chǎn)AHLs活性的影響見圖1。結(jié)果所示，在培養(yǎng)基初始pH值分別為6.0、7.0、8.0時，A.veroniibv.veronii的最大生長總數(shù)無顯著性差異(p>0.05)，分別為1.29、1.45、1.15×109CFU/mL。由此說明，pH范圍為6.0～8.0的培養(yǎng)條件對細(xì)菌的生長無顯著影響，即細(xì)菌生長過程中培養(yǎng)液pH值的變化不影響細(xì)菌的生長狀態(tài)。

圖1 不同pH對A. veronii bv. veronii菌落總數(shù)和AHLs活性的影響Fig.1 The effects of different pH on the bacterial counts and AHLs activity of A. veronii bv. veronii注：a-b不同字母表示同一指標(biāo)內(nèi)差異達到0.05的顯著水平。

通過監(jiān)測報告，菌根癌農(nóng)桿菌的β-半乳糖苷酶活性可用來反映A.veroniibv.veroni在不同pH條件下的AHLs活性。如圖1所示，當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境的初始pH為8.0時，A.veroniibv.veroni培養(yǎng)18 h后的AHLs活性顯著低于pH 6.0和7.0下的AHLs活性(p<0.05)。由此推斷，堿性環(huán)境會降低細(xì)菌分泌的AHLs活性。據(jù)報道，AHLs的高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)在堿性條件下易解環(huán)，具有結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性[15]。綦國紅[16]研究了不同pH對AHLs穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)pH值越高，AHLs的活性越低。

2.1.2 對A.veroniibv.veronii成膜和泳動能力的影響

生物膜是細(xì)菌附著在物體表面的細(xì)胞及其胞外基質(zhì)，是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的主要原因[17]。在食品工業(yè)中，控制細(xì)菌生物膜的產(chǎn)生是亟待解決的重要問題。在本實驗中，利用結(jié)晶紫染色法和CLSM技術(shù)測定pH值對細(xì)菌成膜的影響，結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 不同pH對A. veronii bv. veronii生物膜形成能力和泳動能力的影響Fig.2 The effects of different pH on biofilm formation and swimming motility of A. veronii bv. veronii注：a-b不同字母表示同一指標(biāo)內(nèi)差異達到0.05的顯著水平。

A-pH 6.0；B-pH 7.0；C-pH 8.0；a-熒光照片;b-光鏡照片圖3 在不同pH下A. veronii bv. veronii生物膜結(jié)構(gòu)的CLSM照片F(xiàn)ig.3 The CLSM images of biofilm structure of A. veronii bv. veronii under different pH

結(jié)果顯示，在不同pH下，A.veroniibv.veronii的成膜能力受到一定影響。當(dāng)環(huán)境的pH為8.0時，細(xì)菌的成膜能力均顯著低于pH 6.0、pH 7.0下的兩組數(shù)據(jù)(p<0.05)。由CLSM照片中可以觀察到，在pH 8.0時，細(xì)胞膜中的熒光強度和細(xì)胞密度明顯小于pH 6.0和pH 7.0的組別，且細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)較為疏松，而pH為6.0和7.0的組別之間差異性較小。這說明，當(dāng)環(huán)境呈堿性時，A.veroniibv.veronii的成膜能力顯著低于中性和酸性環(huán)境下細(xì)菌的成膜能力。這可能是因為在堿性環(huán)境下，細(xì)菌的QS系統(tǒng)受到影響，產(chǎn)生的AHLs活性降低，從而影響了其介導(dǎo)的生物膜形成能力。這與2.1.1中AHLs的活性變化是一致的。馬艷等[18]研究發(fā)現(xiàn),環(huán)境pH為7時，菌株的生物被膜形成量最大，被膜中活菌數(shù)最多，且生長環(huán)境的pH值過低或過高均能夠抑制微生物生物被膜的形成。有研究表明，在酸性條件下細(xì)菌的胞外分泌物會發(fā)生變性，而堿性條件會影響菌體聚集，均不利于生物被膜的形成[19-20]。

同時，pH對A.veroniibv.veronii的泳動能力也有一定影響。泳動是細(xì)菌靠鞭毛進行的一種運動模式，指菌體在找到合適的固著位點后在固體平面上擴散，在生物膜形成的早期起著關(guān)鍵作用[21-22]。利用瓊脂平板法，將細(xì)菌點樣在不同酸堿性的平板上靜置培養(yǎng)，形成的菌團如圖4，直徑見圖2。結(jié)果顯示，當(dāng)環(huán)境為pH 8.0時，細(xì)菌的泳動能力均顯著低于pH 6.0、pH 7.0兩組數(shù)據(jù)(p<0.05)，而pH 6.0和pH 7.0的組別之間無顯著性差異(p>0.05)。這與成膜能力的變化結(jié)果是一致的，是因為細(xì)菌的QS系統(tǒng)在堿性環(huán)境下受到影響，從而影響了其介導(dǎo)的泳動能力。目前關(guān)于pH對細(xì)菌泳動能力的影響還未有相關(guān)報道。

圖4 平板觀察法研究不同pH對A. veronii bv. veronii泳動能力的影響Fig.4 The effects of different pH on swimming motility of A. veronii bv. veronii using agar plates method

2.2 NaCl質(zhì)量質(zhì)量濃度對A. veronii bv. veronii QS系統(tǒng)的影響

2.2.1 對菌落總數(shù)和產(chǎn)AHLs活性的影響

NaCl質(zhì)量濃度對A.veroniibv.veronii生長及AHLs活性的影響見圖5。由結(jié)果可知，在不同NaCl質(zhì)量濃度(5、10、20 g/L)下，細(xì)菌A.veroniibv.veronii培養(yǎng)18 h達到穩(wěn)定期后的生長最大數(shù)分別為1.66×109、7.24×108、1.55×107CFU/mL，且各組數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異(p<0.05)。當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為5 g/L時，細(xì)菌的菌落數(shù)最高，隨NaCl濃度增加，菌落數(shù)減少。由此推斷，含鹽量為5 g/L的條件更適宜A.veroniibv.veronii的生長。

對不同鹽含量下A.veroniibv.veronii的AHLs活性變化分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為20 g/L時，細(xì)菌的AHL活性顯著低于NaCl為5 g/L和10 g/L下的AHLs活性(p<0.05)，而在NaCl質(zhì)量濃度為5 g/L和10 g/L下細(xì)菌的AHLs活性無顯著性差異(p>0.05)。JAHID等[11]分析了Aeromonashydrophila在不同含鹽量下培養(yǎng)24 h后產(chǎn)AHLs和AI-2信號分子的分泌情況，發(fā)現(xiàn)A.hydrophila在25 g/L含鹽量下信號分子的濃度或活性最高。MEDINA-MARTNEZ等[10]利用ChromobacteriumviolaceumCV026和A.tumefaeiensA136兩種報告菌檢測了不同含鹽量(5～45 g/L)對不同A.hydrophila菌株產(chǎn)AHL的活性影響，發(fā)現(xiàn)A.hydrophila在高鹽含量下產(chǎn)AHLs活性為陰性，且當(dāng)培養(yǎng)基含鹽量分別高于20、35 g/L時2株報告菌不能檢測到細(xì)菌的AHLs活性。在本試驗中，20 g/L的含鹽量減弱了細(xì)菌分泌AHLs的能力，因而認(rèn)為，高含鹽量不利于A.veroniibv.veronii分泌AHLs信號分子。

2.2.2 對A.veroniibv.veronii成膜和泳動能力的影響

利用結(jié)晶紫染色法和CLSM技術(shù)研究不同NaCl質(zhì)量濃度對細(xì)菌成膜能力的影響，結(jié)果分別見圖6和圖7。結(jié)果顯示，在5 g/L含鹽量的條件下，細(xì)菌的成膜能力最強，當(dāng)培養(yǎng)基中含鹽量增加時，細(xì)菌成膜能力減弱。

圖6 NaCl質(zhì)量濃度對A. veronii bv. veronii成膜和泳動能力的影響Fig.6 The effects of different NaCl concentration on biofilm formation and swimming motility of A. veronii bv. veronii注：a-c不同字母表示同一指標(biāo)內(nèi)差異達到0.05的顯著水平。

A-5.0 g/L NaCl;B-10 g/L NaCl；C-20 g/L NaCl;a-熒光照片;b-光鏡照片。圖7 在不同含鹽量下A. veronii bv. veronii生物膜結(jié)構(gòu)的CLSM照片F(xiàn)ig.7 The CLSM images of biofilm structure of A. veronii bv. veronii under different NaCl concentration

利用CLSM觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)含鹽量為20 g/L時，細(xì)菌生物膜的細(xì)胞密度較小，且結(jié)構(gòu)較為疏松。這說明培養(yǎng)基質(zhì)中NaCl質(zhì)量濃度的變化影響了細(xì)菌的QS系統(tǒng)表達，使細(xì)菌的成膜能力發(fā)生改變。而在馬艷等[18]的研究中，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度達到20 g/L時，菌株的生物膜形成量最大，活菌數(shù)最大。JAHID等[11]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌培養(yǎng)24 h后，其成膜能力在含2.5 g/L NaCl的基質(zhì)中最強，當(dāng)含鹽量為0或逐漸增加時，細(xì)菌的成膜能力顯著降低。然而，MCDOUGALD等[23]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)和葡萄糖的含量是影響創(chuàng)傷弧菌生物膜形成的主要因素，而NaCl質(zhì)量濃度與溫度并未影響其生物膜的形成。本實驗結(jié)果與這些文獻報道的差異性可能與細(xì)菌的來源和種類不同有關(guān)。

利用瓊脂平板法研究NaCl質(zhì)量濃度(5、10、20 g/L)對細(xì)菌泳動能力的影響，如圖6和圖8所示，在20 g/L NaCl的條件下細(xì)菌形成菌團直徑顯著小于5 g/L和10 g/L NaCl下的菌團直徑(p<0.05)。細(xì)菌的泳動能力是受QS調(diào)控的行為，因而該變化與細(xì)菌QS在高NaCl下受到影響有關(guān)。在本實驗中，5 g/L和10 g/L NaCl下的菌團直徑大小無顯著性差異(p>0.05)。關(guān)于環(huán)境因素對細(xì)菌泳動能力的影響還少有報道。在JAHID等[11]的報道中，細(xì)菌的泳動能力在2.5 g/L NaCl條件下最強。

圖8 瓊脂平板法研究不同NaCl濃度對細(xì)菌泳動能力的影響Fig.8 The effects of different NaCl concentration on swimming motility of A. veronii bv. veronii using agar plates method

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基初始pH為pH 8.0時能顯著降低細(xì)菌合成AHLs的能力、成膜能力及泳動能力(p<0.05),這說明堿性環(huán)境能阻礙細(xì)菌產(chǎn)生AHLs，進而阻礙QS系統(tǒng)對細(xì)菌行為的調(diào)控。另外，當(dāng)培養(yǎng)基中的含鹽量為0.5%時細(xì)菌的生長菌落數(shù)最高；而2.0%的含鹽量抑制細(xì)菌的生長，并通過干擾細(xì)菌的QS系統(tǒng)，抑制了其成膜能力及泳動能力(p<0.05)。由此可見，pH和NaCl質(zhì)量濃度能影響細(xì)菌QS系統(tǒng)及代謝行為的表達，這為通過調(diào)控細(xì)菌QS來控制水產(chǎn)品微生物安全的新策略提供理論基礎(chǔ)。

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