肉桂醛或檸檬醛調(diào)控酵母生長對谷胱甘肽合成的影響

孫怡然，萬偉建，段超，劉東國，柳艷云，段學輝

(南昌大學 食品學院食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌，330047)

還原型谷胱甘肽，即γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸(glutathione,GSH)，是生物體內(nèi)最豐富的非蛋白巰基化合物[1]。在生物體中，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)和谷胱甘肽合成酶(GS)利用ATP能量，能將前體氨基酸谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸催化合成GSH[2-3]。谷胱甘肽具有抗氧化、維持細胞酶活的穩(wěn)定、參與DNA和蛋白質(zhì)的合成、抵御內(nèi)毒素以及自由基對細胞的損害等功能[4-7]，在食品中添加GSH，可以提高食品的營養(yǎng)價值，加強風味，防止食品的色澤變化[8]；在醫(yī)藥領(lǐng)域中，GSH可以緩解輻射、化療等對機體造成的副作用，同時對肝病的治療也具有一定的效果[9-10]；在化妝品領(lǐng)域中，GSH可以提高細胞的抗氧化能力，降低色素的積累[11]。然而，眾多研究顯示酵母細胞難以過量連續(xù)合成GSH，其關(guān)鍵原因之一是GSH不能有效分泌到胞外，細胞內(nèi)積累一定濃度的GSH會對合成限速酶谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性產(chǎn)生反饋抑制，限制了細胞內(nèi)GSH的過量連續(xù)合成[12]。

有研究利用物理、化學方法對酵母細胞進行處理，提高細胞的通透性，從改變細胞的傳質(zhì)能力來提高胞內(nèi)產(chǎn)物的合成水平。段學輝[13]等采用氣流干燥、超聲、及低濃度甲苯處理釀酒酵母，改善細胞透性，增強了胞內(nèi)酶的催化合成活性。LI[14]等采用細胞滲透處理結(jié)合兩步法反應，明顯地提高了細胞催化合成GSH的產(chǎn)量。張帥帥[15]等利用40%的乙醇對乳酸克魯維酵母透性化處理，用于催化合成低聚半乳糖，其產(chǎn)量達到98.93 g/L。說明提高細胞的通透性有助于產(chǎn)物的合成。另外，有機分子肉桂醛、檸檬醛在細胞生長過程中對細胞膜真菌麥角甾醇的合成產(chǎn)生影響，從而調(diào)節(jié)細胞膜的合成[16-17]；而且肉桂醛對β(1,3)-葡聚糖以及幾丁質(zhì)的合成具有抑制作用，影響細胞壁的合成[18]。汪琨[19]等利用去氫木香內(nèi)酯處理釀酒酵母，發(fā)現(xiàn)其對細胞內(nèi)β-葡聚糖合酶具有一定的抑制作用。一些抗生素如卡泊芬凈、尼可霉素以及兩性霉素B也有類似的效果[20-21]。

本研究選擇在酵母生長培養(yǎng)液中添加一定濃度的有機小分子化合物肉桂醛或檸檬醛，對酵母細胞生長進行調(diào)控，影響酵母細胞膜和細胞壁的合成，導致生長酵母的細胞膜和細胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生一定變化；并通過考察控制培養(yǎng)細胞酶法合成GSH及細胞外積累能力變化，探討研究肉桂醛、檸檬醛調(diào)控生長對細胞合成GSH的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

絮凝酵母(SaccharomycescerevisiaeSP5)為本實驗室保藏。谷胱甘肽(GSH)、L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸、肉桂醛、檸檬醛：阿拉丁試劑有限公司；無水乙醇、六水合氯化鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、硫酸銨：西隴化工；葡萄糖：天津市大茂化學試劑廠；四氧嘧啶：Maclin。

1.2 方法

1.2.1 GSH測定

采用四氧嘧啶法[22]

1.2.2 細胞培養(yǎng)

參照張倩等[23]培養(yǎng)方法。

種子培養(yǎng)：將斜面種子在30 ℃下活化3 h，取一環(huán)至裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL的錐形瓶中，培養(yǎng)時間24 h，30 ℃溫度下，培養(yǎng)24 h，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min；

發(fā)酵培養(yǎng)：30 ℃ 溫度下，培養(yǎng)36 h，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min；斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20，瓊脂粉20；

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20 ，酵母粉10 ，蛋白胨20 ，培養(yǎng)基初始pH為6.0，滅菌鍋壓強為0.07 MPa，滅菌時間15 min；

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖35 ，酵母粉10，硫酸銨5，肌醇0.1 ，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 0.5，培養(yǎng)基初始pH為6.0，滅菌鍋壓強為0.07 MPa，滅菌時間15 min；

1.2.3 細胞干重(DCW)測定

將發(fā)酵液在8 000 r/min下離心10 min，去除上清液，并用無菌水清洗3次，離心收集菌體，于75 ℃下烘干至恒重。

1.2.4 調(diào)控生長改善細胞傳質(zhì)能力

在發(fā)酵培養(yǎng)初期加入一定濃度的肉桂醛或檸檬醛，調(diào)控生長培養(yǎng)36 h。

1.2.5 生長調(diào)控結(jié)合分段培養(yǎng)方式考察酵母細胞的GSH合成能力

在發(fā)酵培養(yǎng)初期加入一定濃度的肉桂醛或檸檬醛，調(diào)控生長培養(yǎng)24 h后停止搖床，補加一定濃度葡萄糖后靜態(tài)調(diào)控培養(yǎng)12 h，比較組合調(diào)控培養(yǎng)細胞GSH合成能力的變化。

1.2.6 細胞酶催化合成GSH

參照CHEN等[24]的方法，取2 g濕酵母，加入10 mL酶反應液，加入150 mL的搖瓶中，于37 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，恒溫震蕩培養(yǎng)6 h，檢測GSH合成量。

酶反應液(mmol/L)：葡萄糖400，L-Cys 15，L-Gly 40，L-Glu 20，MgCl2·6H2O，反應液用pH為7.0 的檸檬酸緩沖液配置。

1.3 酶法總GSH計算方法

總GSH=胞外GSH+胞內(nèi)GSH

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)中酵母細胞生長及胞內(nèi)GSH的合成

按照酵母培養(yǎng)條件發(fā)酵培養(yǎng)40 h，每4 h取樣收集細胞，測定培養(yǎng)液中生長的細胞濃度(DCW)和胞內(nèi)GSH合成情況，結(jié)果如圖1所示。

圖1 酵母生長及細胞內(nèi)GSH含量變化Fig.1 The change of growth and intracellular GSH concentration of yeast

由圖1可以看出，發(fā)酵培養(yǎng)的前16 h內(nèi)，發(fā)酵液中細胞濃度以及生長細胞內(nèi)GSH含量快速增加，培養(yǎng)到24 h后，細胞量增長緩慢，在培養(yǎng)到36 h，發(fā)酵液中的生物量及其細胞內(nèi)的GSH含量達到最高，分別為8.09 g/L和44 mg/L；在酵母培養(yǎng)的發(fā)酵液中，基本檢測不到GSH的存在，表明胞內(nèi)GSH無明顯分泌。

2.2 肉桂醛及檸檬醛對酵母細胞的生長和GSH合成的影響

在細胞發(fā)酵初期，分別添加0、15、30、45、60、75、90 μg/mL的肉桂醛，質(zhì)量濃度為0、20、40、60、80、100、150、200、250 μg/mL的檸檬醛，發(fā)酵36 h后，收集細胞，檢測細胞內(nèi)外GSH含量以及細胞干重，結(jié)果如圖2、3所示。

圖2 不同濃度肉桂醛調(diào)控酵母的生長和GSH合成Fig.2 Different concentrations of cinnamaldehyde regulate the growth ofyeast and synthesis of GSH

從圖2中可以看出，隨著肉桂醛添加濃度的增加，細胞生長受到抑制，生長酵母細胞的干重逐漸降低；肉桂醛調(diào)控培養(yǎng)細胞合成GSH，隨著其調(diào)控濃度的增加，胞內(nèi)合成積累的GSH含量呈下降趨勢,而細胞發(fā)酵液中合成的GSH含量逐漸增加，當肉桂醛濃度高于60 μg/mL后，發(fā)酵液中合成的GSH含量逐漸降低；在低濃度的肉桂醛濃度調(diào)控下培養(yǎng)的細胞合成GSH的總量有所提高，但不明顯，繼續(xù)提高肉桂醛的調(diào)控濃度，培養(yǎng)細胞的濃度和合成GSH的胞內(nèi)外含量都呈現(xiàn)下降。這可能與細胞生長受到抑制，生長細胞膜合成受阻或結(jié)構(gòu)過度破壞相關(guān)。同樣從圖3中可以看出，與肉桂醛相似，隨著檸檬醛調(diào)控濃度的增加，培養(yǎng)細胞的濃度、胞內(nèi)GSH含量都出現(xiàn)下降，而分泌到胞外的GSH濃度逐漸升高；當檸檬醛調(diào)控濃度高于140 μg/mL后，培養(yǎng)細胞合成GSH的分泌量快速下降，細胞生長受到抑制生物量明顯下降；

圖3 不同濃度檸檬醛調(diào)控酵母的生長和GSH合成Fig.3 Different concentrations of citral regulate the growth of yeast and synthesis of GSH

結(jié)果表明，利用肉桂醛或檸檬醛調(diào)控生長，對培養(yǎng)細胞合成GSH的分泌能力有一定促進作用，低濃度的肉桂醛對細胞進行調(diào)控后，細胞GSH合成總量沒有明顯提高，繼續(xù)提高濃度，細胞GSH合成總量下降，而檸檬醛的調(diào)控，細胞GSH合成總量下降，這可能與細胞生長受到抑制，細胞濃度降低相關(guān)。

2.3 肉桂醛、檸檬醛調(diào)控生長對細胞酶催化合成GSH的影響

收集分別經(jīng)過15、30、45、60、75、90 μg/mL濃度的肉桂醛，或20、40、60、80、100、120、140 μg/mL濃度的檸檬醛調(diào)控生長的培養(yǎng)酵母，取2 g濕細胞，加入10 mL酶反應液中，于37 ℃，180 r/min，進行酶催化合成GSH，反應6 h，檢測細胞內(nèi)外GSH的含量，結(jié)果如圖4和圖5所示。

從圖4可以看出，經(jīng)過一定濃度肉桂醛或檸檬醛調(diào)控生長的酵母，細胞酶催化合成反應液中GSH濃度逐漸提高，催化細胞胞內(nèi)積累GSH量以及酶法合成反應得到的總GSH量也有所提高；當肉桂醛調(diào)控濃度高于60 μg/mL，培養(yǎng)細胞催化合成反應胞內(nèi)積累GSH濃度明顯下降,但合成反應生成的總GSH量趨于平穩(wěn)；從圖5看出，檸檬醛調(diào)控濃度高于40 μg/mL時，生長細胞催化合成反應分泌胞外反應液中的GSH量繼續(xù)增長，而胞內(nèi)積累的GSH量逐漸降低；檸檬醛調(diào)控濃度達到100 μg/mL時，生長細胞催化合成的GSH總量達到相對高值410 mg/L。綜合考慮調(diào)控生長的細胞生物量和培養(yǎng)細胞的酶催化合成GSH的效率，45 μg/mL濃度肉桂醛調(diào)控細胞生長較為合理，培養(yǎng)細胞酶催化合成GSH達到446 mg/L。

圖4 不同濃度肉桂醛調(diào)控生長細胞酶催化合成GSHFig.4 Enzymatic synthesis of GSH by yeast cells regulated with different concentration of cinnamyl aldehyde

圖5 不同濃度檸檬醛調(diào)控生長細胞酶催化合成GSHFig.5 Enzymatic synthesis of GSH by yeast cells regulated with different concentration of citral

2.4 培養(yǎng)模式對細胞生長和合成GSH影響

選用葡萄糖作為碳源，初始發(fā)酵液葡萄糖的添加量為45 g/L，搖瓶裝液量為70 mL/250 mL，在細胞生長到24 h后停止震蕩、補糖及控氧發(fā)酵，研究不同模式發(fā)酵對細胞生長及其GSH合成能力的影響。實驗操作按以下模式：1. 空白；2. 培養(yǎng)24 h后添加25 g/L的葡萄糖，搖床繼續(xù)運轉(zhuǎn)；3. 培養(yǎng)24 h后添加25 g/L的葡萄糖，靜止培養(yǎng)；4. 培養(yǎng)24 h后添加25 g/L的葡萄糖，靜止密封厭氧培養(yǎng)；5. 培養(yǎng)24 h后添加25 g/L的葡萄糖，低速(接近0)控溫(30 ℃)培養(yǎng)。后期繼續(xù)培養(yǎng)12 h，離心收集細胞，檢測生物量和細胞GSH合成能力。實驗結(jié)果如圖6和圖7所示。

圖6 不同發(fā)酵模式對細胞生長和合成GSH能力的影響Fig.6 Effects of different fermentation modes on cell growth and synthesis of GSH

圖7 不同發(fā)酵模式培養(yǎng)的細胞酶催化合成GSH的能力Fig.7 Enzymatic synthesis of GSH by yeast cells cultured in different fermentation modes

從圖6和圖7中可以看出，補加葡萄糖操作對培養(yǎng)細胞的生長及其GSH的合成都具有一定的促進作用；發(fā)酵過程搖床停止對細胞的生長一定的抑制，細胞發(fā)酵合成GSH的量有所降低，但培養(yǎng)細胞酶催化合成GSH的能力提高了，結(jié)果顯示，發(fā)酵培養(yǎng)24 h后補加葡萄糖并靜止培養(yǎng)，生長細胞進行酶催化合成GSH的能力相對明顯較高，其合催化成量達GSH量達到461 mg/L。

2.5 佳選發(fā)酵模式結(jié)合肉桂醛或檸檬醛調(diào)控對細胞生長及其合成GSH的影響

酵母發(fā)酵之前，向培養(yǎng)液中分別加入30、45、60、75、90、105 μg/mL濃度的肉桂醛,或加入60、80、100、120、140、160 μg/mL濃度的檸檬醛，選擇發(fā)酵模式3結(jié)合調(diào)控生長培養(yǎng)細胞，研究其對細胞的生長、培養(yǎng)細胞的GSH合成能力的影響。實驗結(jié)果如圖8和圖9所示。

由圖8和圖9可以看出，肉桂醛或檸檬醛調(diào)控結(jié)合發(fā)酵模式3培養(yǎng)，隨著調(diào)控試劑濃度的增加細胞生長生物量呈下降趨勢，培養(yǎng)細胞的GSH分泌能力逐漸增強；當肉桂醛調(diào)控濃度高于75 μg/mL，或檸檬醛調(diào)控濃度高于120 μg/mL，發(fā)酵液中分泌的GSH濃度逐漸降低，培養(yǎng)細胞合成GSH量總體呈下降趨勢，與生長細胞的生物量減少成正相關(guān)。因此綜合優(yōu)化前后發(fā)酵法合成GSH的情況，可以看出，通過利用肉桂醛、檸檬醛調(diào)控細胞壁、細胞膜的合成，從而提高細胞的傳質(zhì)能力的方法，由于細胞生物量的限制，對于促進發(fā)酵法合成GSH的效果不明顯。

圖8 肉桂醛調(diào)控結(jié)合模式3培養(yǎng)酵母細胞的生長和GSH合成Fig.8 The growth and GSH synthesis of yeast cells regulated by cinnamyl aldehyde cultured in mode 3

圖9 檸檬醛調(diào)控結(jié)合模式3培養(yǎng)酵母細胞的生長和GSH合成Fig.9 The growth and GSH synthesis of yeast cells regulated by citral cultured in mode 3

2.6 佳選發(fā)酵模式結(jié)合肉桂醛、檸檬醛調(diào)控生長對細胞酶催化合成GSH的影響

收集分別經(jīng)過15、30、45、60、75、90 μg/mL濃度的肉桂醛，或20、40、60、80、100、120、140 μg/mL濃度的檸檬醛在發(fā)酵模式三下培養(yǎng)的酵母細胞，取2 g濕細胞，加入10 mL酶反應液中，于37 ℃，進行酶催化合成GSH，反應6 h，檢測細胞內(nèi)外GSH的含量，結(jié)果如圖10和圖11所示。

從圖10可以看出，在佳選模式下，經(jīng)過一定濃度肉桂醛或檸檬醛調(diào)控生長的酵母，細胞酶催化合成反應液中GSH濃度逐漸提高，催化細胞胞內(nèi)積累GSH量以及酶法合成反應得到的總GSH量也有所提高；當肉桂醛調(diào)控濃度達到60 μg/mL，培養(yǎng)細胞催化合成反應胞內(nèi)積累GSH濃度明顯下降,但合成反應生成的總GSH量趨于平穩(wěn)；從圖11看出，檸檬醛調(diào)控濃度達到60 μg/mL后，生長細胞催化合成反應分泌胞外反應液中的GSH量繼續(xù)增長，胞內(nèi)積累的GSH量變化不大，酶法合成反應的總GSH量有所提高；檸檬醛調(diào)控濃度超過100 μg/mL后，生長細胞催化合成反應胞內(nèi)GSH積累量和總GSH量顯著下降。在佳選模式下，選用肉桂醛或檸檬醛調(diào)控細胞的生長，綜合考慮調(diào)控生長的細胞生物量和培養(yǎng)細胞的酶催化合成GSH的效率，45 μg/mL濃度肉桂醛或100 μg/mL的檸檬醛調(diào)控細胞生長較為合理，培養(yǎng)細胞酶催化合成GSH分別達到580 mg/L和551 mg/L，相較未處理細胞分別提高了107%和96.8%。

圖10 肉桂醛調(diào)控結(jié)合模式3培養(yǎng)酵母細胞催化合成GSHFig.10 Enzymatic synthesis of GSH by yeast cells regulated by cinnamyl aldehyde and cultured in mode 3

圖11 檸檬醛調(diào)控結(jié)合模式3培養(yǎng)酵母細胞催化合成GSHFig.11 Enzymatic synthesis of GSH by yeast cells regulated by citral and cultured in mode 3

3 結(jié)論

肉桂醛、檸檬醛對酵母細胞壁、膜的合成具有一定的調(diào)節(jié)作用。本研究利用肉桂醛和檸檬醛對酵母細胞進行生長調(diào)控，考察在肉桂醛或檸檬醛添加后，酵母細胞的生長和合成GSH的情況，以及經(jīng)過肉桂醛或檸檬醛調(diào)控生長的細胞酶催化合成GSH的效率；選擇發(fā)酵培養(yǎng)模式，結(jié)合肉桂醛、檸檬醛調(diào)控生長，考察細胞的生長和GSH的合成，以及調(diào)控生長細胞酶催化合成GSH的能力。結(jié)果顯示，合適培養(yǎng)模式結(jié)合肉桂醛或檸檬醛調(diào)控生長培養(yǎng)細胞，其催化合成GSH的濃度分別達到580 mg/L和551 mg/L，相較未處理細胞的合成能力分別提高107%和96.8%。同時看到，進行調(diào)控生長細胞培養(yǎng)中，發(fā)酵液中細胞分泌GSH量有所提高，細胞的生長受到一定抑制；調(diào)控生長細胞酶催化合成GSH能力和分泌的反應液中的量明顯高于對照細胞。這表明一定濃度的有機小分子化合物肉桂醛或檸檬醛，會影響酵母細胞的生長和細胞膜、壁的合成，導致生長酵母的細胞膜、壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，改善細胞的GSH分泌能力，從而影響細胞的GSH合成的效率。

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