高分子量腈水合酶工程菌生產(chǎn)煙酰胺的工藝建立

郭軍玲，王哲，劉中美，周哲敏

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

腈水合酶(Nitrile hydratase，簡稱NHase，EC 4.2.1.84)是一種能夠催化腈類物質(zhì)生成酰胺類化合物的金屬酶[1]，主要用于工業(yè)上丙烯酰胺和煙酰胺的生產(chǎn)[2]。常見NHase大多數(shù)來源于紅球菌屬(Rhodococcus)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)以及諾卡氏菌(Nocardia)[3]。根據(jù)NHase活性中心所含金屬離子的不同，一般可將其分為鐵型腈水合酶(Fe-NHase)和鈷型腈水合酶(Co-NHase)，他們的活性中心分別含有一個非血紅素鐵離子[4]和一個非咕啉態(tài)鈷離子[1]，并且金屬離子都位于α亞基保守序列-Cys-X-Leu-Cys(SO2H)-Ser-Cys(SOH)上，其中包含兩個被氧化的半胱氨酸殘基：被深度氧化的硫?；?—SO2—)和被淺度氧化的亞硫?；?—SO—)[4-6]。生物體內(nèi)，NHase通常與腈水解酶[7]、酰胺酶[6]這兩種關(guān)鍵酶一起發(fā)揮作用進(jìn)行腈類物質(zhì)代謝。

目前很多化工產(chǎn)品的生產(chǎn)已經(jīng)由傳統(tǒng)的化學(xué)方法轉(zhuǎn)變?yōu)橐悦富蛉?xì)胞為主的生物法[8-9]，NHase就是其中最有代表性的例子，其用于酰胺類物質(zhì)如丙烯酰胺、尼克酰胺以及5-氰基戊酰胺的生產(chǎn)已有數(shù)十年歷史[2]。尼可酰胺是一種水溶性維生素，也是一種用于藥物和殺蟲劑合成的重要中間體，在制藥行業(yè)和食品工業(yè)中有重要應(yīng)用[10-11]。目前用于生產(chǎn)尼可酰胺的菌株為玫瑰色紅球菌RhodococcusrhodochrousJ1(J1)，它也是第三代工業(yè)菌株[12-13]。在J1中同時存在兩種不同類型的腈水合酶，按其分子量不同分為高分子量腈水合酶(H-NHase)和低分子量腈水合酶(L-NHase)。雖然目前工業(yè)生產(chǎn)煙酰胺主要用J1這一生產(chǎn)菌，但其培養(yǎng)時間長，蛋白表達(dá)量低[14-15]。相比較而言，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有明顯的優(yōu)勢：菌體生長速度快，蛋白表達(dá)量高。目前，L-NHase和H-NHase已在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)[16-17]，這就使得用蛋白表達(dá)量高的重組基因工程菌替代現(xiàn)有的工業(yè)用菌成為可能。

大腸桿菌高密度發(fā)酵技術(shù)是一種通過一定的培養(yǎng)方法提高菌體生物量從而提高蛋白表達(dá)量的有效手段[18-19]。目前很多表達(dá)酶蛋白或抗生素等異源物質(zhì)的重組大腸桿菌都實(shí)現(xiàn)了高密度擴(kuò)大培養(yǎng)[20-21]。若想真正在工業(yè)規(guī)模用大腸桿菌替代紅球菌生產(chǎn)煙酰胺，高密度發(fā)酵技術(shù)的實(shí)現(xiàn)就非常有必要。

本研究對細(xì)胞培養(yǎng)基首先進(jìn)行了搖瓶水平優(yōu)化，使菌體生物量和細(xì)胞酶活得到提高；建立煙酰胺生產(chǎn)的催化工藝，使得表達(dá)H-NHase腈水合酶基因大腸桿菌催化煙腈生成終濃度更高的煙酰胺產(chǎn)物；對重組菌進(jìn)行了分批補(bǔ)料擴(kuò)大培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌高密度培養(yǎng)和重組蛋白的大量表達(dá)；最后與實(shí)際生產(chǎn)情況相結(jié)合，用高密度的發(fā)酵罐培養(yǎng)后重組菌進(jìn)行煙腈催化反應(yīng)，產(chǎn)物濃度相比搖瓶發(fā)酵細(xì)胞的催化有進(jìn)一步的提高。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

基因工程菌E.coilBL21(DE3)/pET-24a(+)-nhhBrbsArbsG(BAG)[17]、E.coilBL21(DE3)/pET-24a(+)-nhhBrbsArbsG(BAE)[16]，表達(dá)載體pET-24a(+)以及宿主菌E.coilBL21(DE3)，以上均為實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10.0，酵母提取物 5.0，NaCl 10.0。

2YT培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 16.0，酵母提取物 10.0，NaCl 5.0，IPTG終濃度0.6 mmol/L，CoCl2·6H2O 0.1。

搖瓶優(yōu)化培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 12.0，酵母提取物 6.0，甘油10.0，KH2PO42.31，KH2PO412.54，IPTG終濃度0.6 mmol/L，CoCl2·6H2O 0.1。

5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 12.0，KH2PO413.5，(NH4)2PO44.0，檸檬酸 1.7，MgSO41.68，微量元素 10 mL。

補(bǔ)料培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖500.0，MgSO47.33，酵母提取物 4.0，胰蛋白胨 4.0。

誘導(dǎo)劑(g/100mL)：乳糖 10.0，CoCl2·6H2O 0.8。

微量元素(g/100mL)：FeSO4·7H2O 1.0，ZnSO4·7H2O 0.525，CuSO4·2H2O 0.3，MnSO4·4H2O 0.05，硼砂 0.023，CaCl20.2，鉬酸銨 0.01。

1.1.3 試劑

3-氰基吡啶，梯希愛上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司；尼克酰胺標(biāo)準(zhǔn)樣品，日本和光純藥工業(yè)株式會社；葡萄糖、甘油、培養(yǎng)基中所用各種鹽類、丙烯腈、丙烯酰胺，國藥化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白胨，酵母提取物，英國Oxoid公司。

1.1.4 儀器

高效液相色譜儀HPLC、色譜柱HITACHI LaChrom C18(250 ACHI LaChrom，5 μm)，日立(HITACHI)公司；UV-1800PC 型紫外可見分光光度計，上海美譜達(dá)有限公司；生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；5 L全自動發(fā)酵罐，美國Winpact公司；蠕動泵，蘭格恒流泵有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 搖瓶培養(yǎng)基的正交優(yōu)化

選取甘油、酵母提取物、胰蛋白胨、Co2+這4種主要培養(yǎng)基組分，作為正交試驗(yàn)設(shè)計的因素。試驗(yàn)采用4因素3水平正交試驗(yàn)L9(34)，通過實(shí)驗(yàn)分析它們對產(chǎn)酶和菌體的生長影響情況。

1.2.2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)(搖瓶水平)

將高分子量腈水合酶大腸桿菌重組菌(BAG)在含50 μg/mL卡那霉素LB固體平板上劃線活化，取LB平板上單菌落，接種至5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃，200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7.5 h，取300 μL上述培養(yǎng)物接種至50 mL含50 μg/mL卡那霉素的2YT培養(yǎng)基或搖瓶優(yōu)化培養(yǎng)基中，在37 ℃，200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)至菌液OD600值達(dá)到0.6～1.0時，加入IPTG至終濃度為0.6 mmol/L以及CoCl2·6H2O至終質(zhì)量濃度為0.1 g/L，24 ℃誘導(dǎo)18 h。

1.2.3 重組型基因工程菌全細(xì)胞催化酶活測定

細(xì)胞酶活的測定方法參考之前純酶酶活檢測的方法[15]，細(xì)胞干重比酶活力定義為：26 ℃條件下1 mg細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生煙酰胺的量(U/mgDCW)；單位體積發(fā)酵液酶活力定義為：26 ℃條件下1 mL發(fā)酵液每分鐘催化產(chǎn)生煙酰胺的量(U/mL)。

將100 μL，OD600=1.0的菌體(磷酸緩沖液溶解)加入400 μL，125 mmol/L煙腈溶液中，25 ℃反應(yīng)10 min，500 μL乙腈終止反應(yīng)，加入終止液后立即在4 ℃，12 000 r/min條件下離心1 min，吸取上清。上清稀釋10倍后，用0.22 μm微孔濾膜進(jìn)行過濾，采用C18色譜柱進(jìn)行HPLC檢測，流動相為水和乙腈[V(水)∶V(乙腈)=2∶1]的混合溶液。檢測波長設(shè)定220 nm，柱溫為40 ℃。流速設(shè)定為0.8 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL。

1.2.4 菌體回收

對搖瓶發(fā)酵結(jié)束的菌體測定OD600，按照比例(最終OD600=4.0，8.0或160.0)計算需要離心的發(fā)酵液并離心回收，4 ℃，8 000 r/min條件下離心10 min，棄上清后將剩余菌體用水懸浮成30 mL發(fā)酵液。

1.2.5 底物流加細(xì)胞催化工藝

[22]中的方法。0.5 mol/L的煙腈經(jīng)流動泵以0.38 mL/min、1.5 mL/min的流速加入30 mL，OD600=4.0 的菌液中并不斷攪拌，定期取樣并測定產(chǎn)物的積累量，待產(chǎn)物濃度維持不變時停止流加。流加過程中，體系溫度維持在25～28 ℃范圍內(nèi)。

1.2.6 煙腈底物分批補(bǔ)料細(xì)胞催化工藝

參考文獻(xiàn)[11, 23]的方法。煙腈固體粉末以0.2 mol/L(20.82 g/L)或0.4 mol/L(41.64 g/L)的終濃度加入到30 mL，OD600=8.0或160.0的菌液中并不斷攪拌，當(dāng)批底物反應(yīng)完畢后再加入下一批底物，定期取樣并測定產(chǎn)物的積累量，體系溫度維持在25～28 ℃范圍內(nèi)。

1.2.7 細(xì)胞對煙酰胺的耐受性

1 mol/L的煙酰胺經(jīng)蠕動泵以1 mL/min的流速加入30 mL，OD600=4.0的菌液中并不斷攪拌，定期取樣并測定不同產(chǎn)物濃度下的細(xì)胞酶活，最終計算不同產(chǎn)物濃度下的相對酶活：

(1)

1.2.8 重組型基因工程菌的高密度發(fā)酵工藝

種子培養(yǎng)：從-8 ℃冰箱中取出保存的甘油管，吸取200 μL菌液接種于30 mL含有50 μg/mL卡那青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，置于37 ℃的恒溫?fù)u床中200 r/min培養(yǎng)7.5 h。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：采用5 L Winpact全自動發(fā)酵罐，初始裝液量為2 L。設(shè)置初始pH為7，培養(yǎng)溫度為37 ℃，初始轉(zhuǎn)速200 r/min，通氣量為5 L/min。將上步所得的種子液以6%的接種量接入發(fā)酵罐中，同時加入卡那青霉素至終質(zhì)量濃度為50 μg/mL，接入種子液后將發(fā)酵罐的溶氧與轉(zhuǎn)速相偶聯(lián)，控制罐內(nèi)溶氧維持在30%，在接種5～6 h后出現(xiàn)溶氧反彈現(xiàn)象，此時以比生長速率μ=0.2/h的指數(shù)流加補(bǔ)料策略進(jìn)行補(bǔ)料。每隔2～3 h取樣1次并測定罐內(nèi)細(xì)胞密度、葡萄糖濃度、乙酸濃度以及細(xì)胞酶活。整個發(fā)酵過程中通過流加25%的氨水調(diào)節(jié)pH，使罐內(nèi)pH始終維持在7.0左右，當(dāng)OD600達(dá)到60左右時，改變溫度為30 ℃，以0.22 g/(L·h)的恒流速流加乳糖和鈷離子進(jìn)行誘導(dǎo)。

1.2.9 分析方法

菌體生物量：紫外可見分光光度計測定OD600值，根據(jù)OD600值和細(xì)胞干重關(guān)系進(jìn)行換算：1 g DCW/L=0.368 3 OD600

葡萄糖含量：使用SBA-40E生物傳感分析儀。

乙酸含量：采用高壓液相法。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶培養(yǎng)基的正交優(yōu)化

本研究選取甘油、酵母提取物、胰蛋白胨、Co2+這4個主要培養(yǎng)基組,分別采用4因素3水平正交試驗(yàn)L9(34)，對高分子量腈水合酶大腸桿菌重組菌(BAG)在不同組合下的菌體生物量和細(xì)胞產(chǎn)酶情況進(jìn)行了考察，并與優(yōu)化前的培養(yǎng)基作對比。

依據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計表，各個因素分別選取3個水平。表1是正交試驗(yàn)設(shè)計表，表2是試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析表。實(shí)驗(yàn)后通過極差分析(表3)和方差分析(表4)可得出培養(yǎng)基中各組分對酶活影響大小的排序和影響酶活的顯著性因素，最終得到優(yōu)化組合。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計表

表2 L9(34)直觀分析表Table 2 L9(34) visual analysis test

表3 培養(yǎng)基中各組分的重要性排序及分析Table 3 Significance analysis for factors of fermentationmedium

表4 培養(yǎng)基中各組分方差分析Table 4 Variance analysis for factors of fermentation medium

通過極差分析，得到了培養(yǎng)基中各組分對酶活影響大小的排序，而根據(jù)方差分析中的F值大小，發(fā)現(xiàn)其得到的重要性程度排序與極差分析得到的結(jié)果相同，其中影響最顯著的因素是胰蛋白胨。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到了最優(yōu)培養(yǎng)基：胰蛋白胨12 g/L，酵母提取物6 g/L，甘油10 g/L，CoCl2·6H2O 0.1 g/L。

如表5所示，BAG優(yōu)化后的細(xì)胞生物量是優(yōu)化前的1.2倍，從3.68 gDCW/L提高到4.42 gDCW/L，細(xì)胞比酶活為優(yōu)化前的3.8倍，從8.06 U/mgDCW提高到30.91 U/mgDCW。

表5 培養(yǎng)基優(yōu)化前后BAG菌體量和酶活變化Table 5 The change of biomass and enzyme activity ofBAG after the optimization of culture media

2.2 BAG煙腈底物流加工藝

參考丙烯酰胺生產(chǎn)中的丙烯腈流加工藝，對BAG進(jìn)行煙腈流加實(shí)驗(yàn)，并測定生成的煙酰胺質(zhì)量濃度。如圖1，無論底物流加速率快慢(0.38 mL/min、1.5 mL/min)，在反應(yīng)開始都有底物積累現(xiàn)象，終產(chǎn)物質(zhì)量濃度只到39.12 g/L?？紤]到煙腈在水中溶解度較低，所以下步實(shí)驗(yàn)考慮采用固體底物分批補(bǔ)料的工藝來提高產(chǎn)物濃度。

圖1 BAG催化煙腈生成煙酰胺Fig.1 Hydration reaction of 3-cyanopyridine to nicotinamide catalyzed by BAG注：流加速率：—■—0.38mL/min、—●—1.5 mL/min，實(shí)心表示產(chǎn)物，空心表示底物，形狀相同表示流速相同。

2.3 煙腈底物分批補(bǔ)料工藝

為了使反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物濃度更高，對基因工程重組菌進(jìn)行煙腈底物分批補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)，并對生成的煙酰胺濃度進(jìn)行測定。因?yàn)榉磻?yīng)體系基本不變而不斷添加底物，所以這種催化方式會使產(chǎn)物大量積累，考慮到高濃度煙酰胺對酶和細(xì)胞可能會產(chǎn)生影響，首先考察了BAG對產(chǎn)物的耐受性，同時用低分子量腈水合酶大腸桿菌重組菌(BAE)作為對照。如圖2，BAE對煙酰胺耐受能力較差，在煙酰胺濃度達(dá)到0.8 mol/L時相對酶活已經(jīng)低于10%，而重組菌BAG對產(chǎn)物耐受能力較強(qiáng)，產(chǎn)物濃度到達(dá)0.8 mol/L時相對酶活依舊維持在95%以上。這就說明高分子量腈水合酶具有更優(yōu)的產(chǎn)物耐受性，其反應(yīng)持續(xù)性較強(qiáng)，在產(chǎn)物大量積累的情況下有能力維持反應(yīng)初期的催化速率。

圖2 BAG和BAE對煙酰胺的耐受性Fig.2 The tolerance to nicotinamide of BAG and BAE

向體積為30 mL，OD600=8.0 的重組菌BAG中分批加入終濃度為0.2 mol/L(20.82 g/L)的煙腈，待底物完全反應(yīng)后再加入下一批，當(dāng)反應(yīng)速率下降后停止反應(yīng)結(jié)果如圖3所示。

圖3 BAG分批補(bǔ)料催化煙腈生成煙酰胺(OD600=8.0)Fig.3 Hydration reaction of 3-Cyanopyridine to nicotinamide catalyzed by BAG (OD600=8.0) during the fed-batch reaction

可以看到在反應(yīng)初期細(xì)胞大約10 min可反應(yīng)完一批底物，且可以在比較長的時間維持這個速率，在產(chǎn)物質(zhì)量濃度達(dá)到250 g/L左右時反應(yīng)速率依舊不變，隨后雖然有所下降，但下降幅度不大，在反應(yīng)進(jìn)行到220 min時停止了反應(yīng)，產(chǎn)物終質(zhì)量濃度達(dá)到了390 g/L，與之前文獻(xiàn)報道[11]用重組大腸桿菌催化煙腈8 h產(chǎn)物質(zhì)量濃度達(dá)到240 g/L相比有了很大的提高。

2.4 重組菌BAG高密度發(fā)酵工藝

要想使重組基因工程菌應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中就必須實(shí)現(xiàn)大腸桿菌的高密度發(fā)酵，通過菌體密度的提高實(shí)現(xiàn)重組蛋白的大量表達(dá)。因此我們以分批補(bǔ)料的策略實(shí)現(xiàn)重組大腸桿菌的擴(kuò)大培養(yǎng)。如圖4，經(jīng)過50 h的發(fā)酵，菌體在48 h時生物量達(dá)到最大值，為 73.97 gDCW/L(OD600=200)；細(xì)胞比酶活在44～48 h達(dá)到最高，為 42.7 U/mgDCW，與搖瓶發(fā)酵相比(30.91 U/mgDCW)有一定的提高；單位發(fā)酵液酶活在44 h左右最高，為 2 813 U/mL。與之前文獻(xiàn)報道[24]的單位發(fā)酵液酶活在60 h達(dá)到2 170 U/mL相比有一定提高。整個補(bǔ)料過程中葡萄糖積累量不超過0.3 g/L，乙酸基本沒有積累(圖5)，說明按照比生長速率μ=0.21 /h進(jìn)行指數(shù)流加是合適的。由此，重組菌BAG的高密度發(fā)酵工藝初步建立。

圖4 BAG5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料培養(yǎng)Fig.4 Fed-batch culture course in a 5 L fermenter of BAG

圖5 葡萄糖和乙酸質(zhì)量濃度Fig.5 Concentration of glucose and acetic acid

結(jié)合實(shí)際的生產(chǎn)情況，取發(fā)酵液并將其調(diào)整到 OD600=160.0，向總體積為 30 mL 的發(fā)酵液中間歇添加 0.4 mol/L(41.64 g/L)煙腈進(jìn)行底物分批補(bǔ)料反應(yīng)。如圖6，因?yàn)榫w生物量較大，反應(yīng)速率很快，產(chǎn)物質(zhì)量濃度在1 h即達(dá)到537 g/L，隨后反應(yīng)速率因產(chǎn)物抑制已經(jīng)不高，所以中止反應(yīng)。

圖6 BAG(OD600=160.0)分批補(bǔ)料催化煙腈生成煙酰胺Fig.6 Hydration reaction of 3-Cyanopyridine to nicotinamide catalyzed byBAG (OD600=160.0) during the fed-batch reaction

由圖6可知，在高密度菌體的情況下，反應(yīng)開始時只用較短時間進(jìn)行1個反應(yīng)周期，但是隨著煙酰胺濃度增高，催化速率都開始下降。R.rhodochrousJ1在 5 h 時能生成 732 g/L 產(chǎn)物[25]，與其相比，重組菌BAG還達(dá)不到這樣高的產(chǎn)物濃度，這與紅球菌和大腸桿菌本身對有機(jī)物的耐受性差異有關(guān)。

R.rhodochrousJ1的發(fā)酵周期需要100 h，并且細(xì)胞酶活(2 100 U/mL[26])比BAG要低很多。相反，BAG只有R.rhodochrousJ1一半的發(fā)酵周期就可以生產(chǎn)出濃度符合工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)品。BAG的生產(chǎn)效率[537 g/(L·h)]是R.rhodochrousJ1[162.8 g/(L·h)][27]的212%。

J1發(fā)酵周期較長，反應(yīng)速率也較慢，催化時間長，生產(chǎn)效率不高，而大腸桿菌與之相比則有自己的優(yōu)勢，在達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)下，其較短的發(fā)酵周期和較高的蛋白表達(dá)量可以大大提升生產(chǎn)效率，具有廣闊的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

本研究通過搖瓶培養(yǎng)基的優(yōu)化使重組菌BAG的生物量提高到4.42 gDCW/L，細(xì)胞比酶活達(dá)到30.91 U/mgDCW。通過比較不同的煙腈催化工藝，發(fā)現(xiàn)底物分批補(bǔ)料的方法最適合煙酰胺的生產(chǎn)。煙腈經(jīng)過搖瓶發(fā)酵的BAG催化后，最終生成390 g/L煙酰胺。對BAG進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，菌體生物量達(dá)到73.97 gDCW/L，細(xì)胞比酶活為42.70 U/mgDCW，單位發(fā)酵液為2 813 U/mL，用較高密度的發(fā)酵罐培養(yǎng)后重組菌進(jìn)行煙腈催化反應(yīng)，產(chǎn)物質(zhì)量濃度能達(dá)到537 g/L。

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