一例產(chǎn)氣莢膜梭菌的實(shí)驗(yàn)室診斷報(bào)告

牛天明，王永強(qiáng)，李天旭，白皓承，劉 鍇★.2

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 082000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)肉牛疾病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

內(nèi)蒙古通遼市某肉羊牧場(chǎng)飼養(yǎng)的肉羊突然快速死亡，于是養(yǎng)殖戶將死羊帶到我校獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行化驗(yàn)，經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查、動(dòng)物剖檢、實(shí)驗(yàn)室診斷等方法，確定致病菌為產(chǎn)氣莢膜梭菌，現(xiàn)將診斷過程如下：

1 發(fā)病情況

該牧場(chǎng)一共飼養(yǎng)360只肉羊，其中大羊285只，小羊75只，在一周前，突然有幾只大羊發(fā)蔫、進(jìn)食困難、精神萎靡、幾小時(shí)后，倒地死亡，死后腹部有所膨大，口鼻有泡沫狀液體流出，眼結(jié)膜潮紅，肛門外凸，唇部有少量的水泡潰瘍。

對(duì)羊進(jìn)行病理解剖檢查，發(fā)現(xiàn)瘤胃及腸道充氣，打開瘤胃，可見很多未消化的飼料，剪開十二指腸，腸粘膜有絲狀出血并且粘膜脫落，腸系膜淋巴結(jié)腫大，脾臟表面有暗紅色出血點(diǎn)，腹腔積液。打開胸腔后，可見肝的顏色發(fā)白，膽囊充盈，心包積液，心衰，質(zhì)感柔軟，心耳呈紫黑色，肺部有少量的炎性壞死灶，腎臟表面淤血。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1 病料染色鏡檢

無菌操作取出死羊的心、肝、脾、肺、腎、十二指腸，分別觸片，革蘭氏染色，鏡檢，可觀察到兩端鈍圓著色，有莢膜，革蘭氏陽性短桿菌，部分桿菌有芽孢。（見圖1）

圖1 革蘭氏染色

2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

將上步取出的臟器分別接種到鮮血瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)，37℃，厭氧培養(yǎng)12h，挑取長出的菌落在鮮血瓊脂平板上畫線接種培養(yǎng)，可見圓形、邊緣整齊、灰白色、表面粗糙溶血菌落，溶血直徑在10～15mm，經(jīng)革蘭氏染色，鏡檢為陽性芽孢桿菌，再將單菌落接種普通液體LB內(nèi)，37℃，純培養(yǎng)12h。

2.3 致病性實(shí)驗(yàn)

將純培養(yǎng)液，12000r/min離心5min，吸取上清液0.5mL/只，腹腔注射，注射5只小鼠，另外注射5只小鼠0.5mL的生理鹽水作為對(duì)照組，結(jié)果4h左右，注射純培養(yǎng)液的小鼠，開始出現(xiàn)精神萎靡、躁動(dòng)不安、閉眼發(fā)蔫等癥狀。8h左右，開始出現(xiàn)死亡，而注射生理鹽水的小鼠未出現(xiàn)任何癥狀。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖檢，可見小鼠脾臟有出血點(diǎn)，腎臟淤血，將其觸片染色鏡檢，可見陽性芽孢桿菌。確定該菌為致病菌。

2.4 藥物敏感試驗(yàn)

將該菌進(jìn)行藥物敏感實(shí)驗(yàn)，可知該菌對(duì)強(qiáng)力霉素、氯霉素、四環(huán)素、阿米卡星等藥物敏感，而對(duì)氨芐西林、頭孢噻肟等藥物不敏感，最終可用強(qiáng)力霉素、四環(huán)素等抗生素對(duì)發(fā)病肉羊進(jìn)行治療。

3 分子生物學(xué)診斷

3.1 16s DNA的鑒定

首先對(duì)細(xì)菌進(jìn)行DNA的提取，設(shè)計(jì)16s DNA通用引物，對(duì)其DNA進(jìn)行PCR鑒定，16s DNA引物序列上游引物27F序列為AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，下游引物1429R序列為GGTTACCTTGTTACGACTT。

PCR反應(yīng)體系，采用25μL反應(yīng)體系，2μL PCR buffer（mg2+），1μL dNTP、上下游引物各 1μL、DNA 模板 2μL、Taq酶0.5μL、用水補(bǔ)齊至25μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min、94℃變性 30s、56℃退火 30s、72℃延伸 1 min、共 30 個(gè)循環(huán)、72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳，染色觀察（如圖2），并將PCR產(chǎn)物送到上海某公司測(cè)序

圖2PCR電泳圖

3.2 同源性比對(duì)

將測(cè)序結(jié)果在NCBI Blast上比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示，與產(chǎn)氣莢膜梭菌同源性最高，相似率99%以上。由此可知，這例引起羊快速死亡的致病菌為產(chǎn)氣莢膜梭菌。

4 預(yù)防與治療

內(nèi)蒙古地區(qū)產(chǎn)氣莢膜梭菌每年在3～5月、10～12月高發(fā)，主要原因受本地的環(huán)境溫度變化導(dǎo)致的，春季氣溫回升，但不穩(wěn)定。冬季溫度下降快，晝夜溫差大等原因，都是產(chǎn)氣莢膜梭菌發(fā)生的誘因。所以在高發(fā)時(shí)間，做好疫苗的免疫，目前，三聯(lián)四防苗可有效的預(yù)防和控制產(chǎn)氣莢膜梭菌的發(fā)生。飼養(yǎng)管理差也可能是導(dǎo)致產(chǎn)氣莢膜梭菌發(fā)病的另一誘因，飼料的突變，突然的應(yīng)激，畜舍的環(huán)境都可能產(chǎn)生產(chǎn)氣莢膜梭菌發(fā)病。另外，產(chǎn)氣莢膜梭菌發(fā)病不是單一種致病菌，常繼發(fā)其他類疾病，所以在使用抗生素治療時(shí)，切勿使用磺胺類藥物和多粘菌素類藥物，有可能加重發(fā)病動(dòng)物的病情。