羊附紅細胞體解離方法的比較研究

唐 成

（四川省遂寧市船山區(qū)畜牧食品局，四川 遂寧 629000）

動物附紅細胞體病是豬、牛、羊等多種動物包括人都能感染的人畜共患傳染病。羊附紅細胞體病的臨床特征為貧血、體質虛弱。該病主要多發(fā)于綿羊養(yǎng)殖和生產比較多的國家，但其發(fā)病率不高，多呈潛伏感染，所以診斷有一定的難度。對羔羊的影響是發(fā)育不良，死亡率較低。目前該病的診斷多通過鏡檢，但準確性較差，已得到了業(yè)界的關注和研究。建立血清學診斷以及分子生物學診斷的前提條件是抗原純化。而當前對該病的血清學診斷主要是利用粗制附紅細胞體抗原，在抗原制備過程中，對溶液進行振蕩和水溶操作易造成溶血現(xiàn)象，導致檢測結果不準確。因此，研究出了一種羊附紅細胞體高純度抗原的有效制備方式——體外驅蟲法。這一方法對羊附紅細胞體病的診斷提供了先進的技術基礎。

1 試驗材料

主要是采集本地區(qū)羊養(yǎng)殖場的羊血，數(shù)量要大于800mL。在實驗中主要使用的制劑是雙向紅蓮滅，規(guī)格是每支10mL，由江西某動物藥生產。

2 試驗方法

2.1 血樣采集

無菌采集羊血并加入檸檬酸鈉抗凝劑。涂片鏡檢，紅細胞感染率為10%左右，符合本次實驗要求。

2.2 羊附紅細胞體解離

將800mL的羊血平均分成4份，每份200mL。并分別標號為A、B、C、D。每份具體使用的解離方法如表1所示。

表1 羊附紅細胞體解離方法

A組使用的是水溶法。具體的實驗方法是將血液樣本經過2000r/min的速度進行離心，10min以后去除了樣本當中的血漿和白細胞等其他干擾物質。然后將剩余的紅細胞用生理鹽水洗3次。加入pH 2 PBS后上搖床振搖1h。而后立即用大約56℃的水對處理后的樣本進行水浴2min。再離心10min后取上清液。

B、C、D組用的都是藥物體外驅蟲法。離心、生理鹽水洗滌步驟同上。然后將處理后的樣本加入足量的生理鹽水至200mL，再加入準備好的雙向紅蓮滅0.5mL，置4℃放置36h。這三組的步驟基本一致，差別在于雙向紅蓮滅的劑量，C組使用的是1mL，D組使用的是2mL。

2.3 指標觀察

主要是觀察分離前后附紅細胞體感染率（%）、紅細胞感染強度（個）、附紅細胞體數(shù)（1×104／mm3）、雜質含量和附紅細胞體的運動性，一共是5項指標。

2.4 提取附紅細胞體抗原

將藥物體外驅蟲法解離后的血液進行離心10min后取上清液。將水浴法和藥物體外驅蟲法所得的上清液離心40min，沉淀物就是附紅細胞體抗原，加入生理鹽水2mL。

2.5 制備羊附紅細胞體抗原全蛋白懸液

將取得的羊附紅細胞體抗原用超聲波裂解約10min，即得到羊附紅細胞體抗原全蛋白懸液。

2.6 羊附紅細胞體全蛋白的SDS-PAGE

將這兩中解離方法制備的全蛋白裂解液，按照SDS-PAGE的方式進行相關的處理，比較兩者的區(qū)別。（見圖1）

3 結果與分析

從表2可知，實驗結果顯示，使用體外驅蟲法的三組其解離效果要好過水溶法。使用體外驅蟲法的樣本其紅細胞的感染率和感染的強度都會降低，但是附紅細胞體的活性受到一定的影響。而且根據(jù)實驗3組的分析來看，雙向紅蓮滅的濃度越高其解離效果越好。

從表3結果可以解離液裂解后測定的抗原蛋白濃度與使用體外驅蟲法雙向紅蓮滅的劑量成正相關。

用SDS－PAGE試驗對利用水浴法與體外驅蟲法制備的全蛋白測定得知，兩者成分相同，都由4條帶組成。

表2 不同方法附紅細胞的解離效果

表3 抗原蛋白質濃度測定結果

4 討論與分析

針對羊附紅細胞體的解離方法，國內外動物學家都進行了一定的研究。水溶法是一種比較常用的方式，但有一定的缺陷，會影響到結果的準確。本文采用體外驅蟲法對羊附紅細胞體解離的效果好于水溶法。所以筆者認為，可以使用這種方法制備羊附紅細胞體的抗原。但在實驗的過程當中，我們也發(fā)現(xiàn)了該法的缺陷，有少量的溶血現(xiàn)象出現(xiàn)，所以該法還有一定的改進空間。

圖1 羊附紅細胞體抗原蛋白的SDS-PAGE電泳

[1]楊峰.農區(qū)散養(yǎng)戶羊布病免疫技術要點及注意事項[J].甘肅畜牧獸醫(yī).2017(10).

[2]彭海生,等.畜禽附紅細胞體生物學特性試驗研究[J].畜牧與獸醫(yī).2015(01).