結(jié)核RNA聚合酶的電鏡研究

崔宇潤(rùn)

（北京十一學(xué)校高三五班，北京 100039）

1 背景

1.1 結(jié)核分枝桿菌的危害

結(jié)核桿菌（TB）侵入人體或者動(dòng)物機(jī)體后引起結(jié)核病，結(jié)核病是一種具有強(qiáng)烈傳染性的慢性消耗性疾病。它不受性別、種族、年齡、職業(yè)、地區(qū)的影響。人體或者動(dòng)物機(jī)體的許多器官、系統(tǒng)均可感染結(jié)核桿菌造成結(jié)核病，其中以肺結(jié)核最為常見(jiàn)。其中90%以上的肺結(jié)核是通過(guò)呼吸道傳染而來(lái)的。肺結(jié)核患者可以通過(guò)咳嗽、打噴嚏，使帶有結(jié)核桿菌的飛沫噴出體外。健康人或者易感動(dòng)物吸入結(jié)核桿菌后便會(huì)感染發(fā)病。

（1）致病性 結(jié)核桿菌的致病作用可能與細(xì)菌在組織細(xì)胞內(nèi)頑強(qiáng)增殖而引起的炎癥反應(yīng)，從而誘導(dǎo)人或者動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)性損傷有關(guān)。結(jié)核桿菌主要通過(guò)呼吸道、消化道和破損的皮膚黏膜等進(jìn)入人體或者動(dòng)物機(jī)體，侵犯不同組織器官，引起對(duì)應(yīng)器官的結(jié)核病。

（2）抵抗力 結(jié)核桿菌具有很強(qiáng)的抵抗力，對(duì)某些理化因子的抵抗力較強(qiáng)，大部分可在干痰中存活6～8個(gè)月。對(duì)濕熱、紫外線、酒精的抵抗力弱。在強(qiáng)酸強(qiáng)堿溶液中能耐受30min。但在液體中加熱到62℃～63℃15min，直射日光下2～3h，或75%酒精內(nèi)數(shù)分鐘就很快死亡。

（3）傳染性 結(jié)核桿菌的傳播方式主要呼吸道、消化道和破損的皮膚黏膜等傳染，隨地吐痰最直接污染了生活的環(huán)境，是傳播該病的元兇。另外還有消化道傳染，因?yàn)槌巳艘酝?，牛等?dòng)物也會(huì)患結(jié)核病，如果母?；冀Y(jié)核病，其奶中也會(huì)帶有結(jié)核桿菌，若人喝了帶有病菌的生牛奶，就會(huì)感染結(jié)核病。結(jié)核桿菌侵入人體后是否發(fā)病，除與細(xì)菌的數(shù)量和毒力都有關(guān)，還與人體和動(dòng)物機(jī)體對(duì)結(jié)核桿菌的抵抗力有關(guān)。如果機(jī)體抵抗力（免疫力）低下，結(jié)核桿菌的入侵不能被機(jī)體防御系統(tǒng)消滅，就會(huì)不斷繁殖，引發(fā)結(jié)核病。

痰涂片檢查顯示，抗酸桿菌陽(yáng)性的結(jié)核病患者才具有傳染性，而且也才是結(jié)核病的傳染源。傳染性肺結(jié)核患者的肺部病灶有很多結(jié)核桿菌，當(dāng)咳嗽或打噴嚏時(shí)，會(huì)有大量的結(jié)核桿菌從呼吸道播散出來(lái)，附著在空氣的飛沫里，并長(zhǎng)時(shí)間懸浮在空氣中。如果健康人或動(dòng)物吸進(jìn)這些含有結(jié)核桿菌的飛沫就有可能受到結(jié)核桿菌的感染，并在肺部形成病灶。因此，結(jié)核病的傳染性與患者的病情、排菌量、咳嗽的頻率、居住房子的通風(fēng)情況及接觸者的密切程度及抵抗力有關(guān)。

1.2 結(jié)核分枝桿菌的抑制藥物

結(jié)核病是一種慢性緩發(fā)的重大傳染性疾病，通過(guò)呼吸道傳播，主要發(fā)生人體肺部感染，同時(shí)，頸淋巴、腦膜和腹膜等組織也可繼發(fā)感染。病灶里出現(xiàn)結(jié)核結(jié)節(jié)，并伴有干酪樣壞死，臨床上主要表現(xiàn)為全身癥狀、咳嗽和咯血等癥狀。該病的病原體是結(jié)核分枝桿菌，這是一種生長(zhǎng)緩慢的需氧菌，外形呈棒狀。早期的藥物（如利福平、異煙肼等）對(duì)結(jié)核桿菌具有良好的抑制作用，在臨床應(yīng)用中產(chǎn)生了很好的效果。然而近年來(lái)，濫用藥物致使耐藥性結(jié)核桿菌和超級(jí)耐藥性結(jié)核桿菌的出現(xiàn)，造成抗結(jié)核藥物的藥效急劇下降。因此，尋找新型藥物靶點(diǎn)研發(fā)抗結(jié)核藥物迫在眉睫。

1.3 聚合酶德抗結(jié)核作用

1.3.1 DNA聚合酶Ⅰ DNA聚合酶Ⅰ是在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型提出后被發(fā)現(xiàn)的，阿瑟·科恩伯格在研究過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。在其研究成果的推動(dòng)下，大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ得到進(jìn)一步揭示，并催生了PCR技術(shù)的問(wèn)世，同時(shí)也促進(jìn)了其他DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)。

早在1955年，M.Crunberg-Manago和S.Ochoa就已報(bào)道分離出了催化合成RNA的酶，盡管人們隨后發(fā)現(xiàn)他們分離得到的酶是多聚核苷磷酸化酶，但是他們發(fā)現(xiàn)的酶在M.Nirenberg和J.H.Matthaei合成第一個(gè)遺傳密碼子中發(fā)揮了重要作用。S.Ochoa因闡明RNA生物合成機(jī)制而獲得了1959年諾貝爾生理學(xué)／醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。1959年，美國(guó)科學(xué)家J.Hurwitz在大腸桿菌的抽提液中分離得到了真正的RNA聚合酶。與此同時(shí)，S.B.Weiss在大鼠肝細(xì)胞核提取物中也發(fā)現(xiàn)了參與RNA合成的物質(zhì)。他們發(fā)現(xiàn)，提純的RNA聚合酶在體外能夠以DNA為模板，在加入ATP、CTP、CTP、UTP及Mg2+等后合成RNA，合成的RNA與DNA模板鏈完全互補(bǔ)。DNA聚合酶被正式發(fā)現(xiàn)，證實(shí)了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的正確性，并說(shuō)明DNA是能自我復(fù)制的分子，標(biāo)志著人類首次掌握了制造遺傳物質(zhì)的方法。

1.3.2 近年來(lái)的研究熱點(diǎn) 近年來(lái)，隨著真核細(xì)胞DNA體外模型的構(gòu)建與建立，蛋白純化技術(shù)的廣泛提高和應(yīng)用，以及對(duì)DNA聚合酶基因的克隆技術(shù)，對(duì)真核細(xì)胞DNA聚合酶研究取得了飛速進(jìn)展。目前已經(jīng)在人體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了15種DNA聚合酶，可以分為以下4類：A類,包括γ、θ及其它聚合酶,γ是目前發(fā)現(xiàn)的唯一存在于線粒體的聚合酶。在今年，酵母菌RNA、人RNA也發(fā)現(xiàn)了類似的研究。

其他原核生物的RNA pol在結(jié)構(gòu)和功能上均與大腸桿菌相似。抗生素——利福平（rifampicin）或利福霉素可以特異抑制原核生物的RNA pol，成為抗結(jié)核菌治療的藥物。它專一性地結(jié)合RNA聚合酶的β亞基。并在轉(zhuǎn)錄開(kāi)始后加入利福平，仍能發(fā)揮其抑制轉(zhuǎn)錄的作用，這說(shuō)明β亞基是在轉(zhuǎn)錄全過(guò)程都起作用的。

1.3.3 立題依據(jù)及意義 本課題建立的原因是結(jié)核桿菌（TB）RNA聚合酶還沒(méi)有電鏡研究，因此結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展和電鏡的快速發(fā)展，可以直觀的觀察到RNA聚合酶效果。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 目的蛋白的表達(dá)及純化

2.1.1 載體的構(gòu)建 利用大腸桿菌質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，將目的蛋白DNA序列導(dǎo)入大腸桿菌質(zhì)粒（5亞基分別轉(zhuǎn)入），培養(yǎng)該大腸桿菌，提取蛋白。

2.1.2 用BL21表達(dá)目的蛋白，細(xì)胞溶菌作用釋放蛋白質(zhì)。2.1.2 用Ni-NTA agarose beads孵化，鹽溶液清洗。

2.1.3 拿咪唑和buffer配，從0、20mM、40mM......100mM濃度進(jìn)行洗脫。

2.1.4 SDS-page檢測(cè)。

2.2 負(fù) 染

2.2.1 用一根細(xì)的吸管吸一滴樣品懸液，滴到有膜的銅網(wǎng)上，滴樣時(shí)要注意防止銅網(wǎng)污染，如注意通網(wǎng)是否被液體吸到管上來(lái)或翻轉(zhuǎn)而被污染。

2.2.2 制樣用碳膜，用鑷子夾著銅網(wǎng)，滴液后靜置10min，然后用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余液體，滴負(fù)染色液，1～2min染色后用濾紙吸去負(fù)染色液，滴蒸餾水在銅網(wǎng)上洗1～2次，用濾紙吸去多余水分，待干后用于電鏡觀察.

2.2.3 干燥時(shí)，由于表面張力的作用，某些敏感的材料可能受到損傷，可用戊二醛或四氧化鋨預(yù)固定。預(yù)固定在滴樣之后進(jìn)行。

2.3 冷凍樣品制樣

包括制樣過(guò)程、制樣方法。

2.3.1 冷凍方法制備樣品低溫掃描電子顯微術(shù)是80年代迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用的方法。冷凍固定將生物材料投入低溫的致冷劑中，如液氦、液氮、液體氟利昂及丙烷等。它包括生物樣品的冷凍固定、冷凍干燥、冷凍割斷和冷凍含水樣品的掃描電子顯微術(shù)等?？焖倮鋬隹墒股锝M織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成接近于生活狀態(tài)。被冷凍固定的生物樣品，可以在低溫條件下轉(zhuǎn)移到具有低溫樣品臺(tái)的掃描電子顯微鏡中直接觀察無(wú)需進(jìn)一步處理或僅在冷凍樣品表面噴鍍一薄層金屬。這種方法不僅快速簡(jiǎn)便，而且可以排除由于干燥法造成收縮的假象，特別適合于研究含水量很高的生物材料。

2.3.2 切片樣品厚度大于5 mμ高壓冷凍，然后切片，檢查冰層、樣品分布。

2.3.3 觀察與結(jié)果統(tǒng)計(jì)觀察以后，最后進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。

3 結(jié)果

3.1 目的基因的構(gòu)建、蛋白制備及純度測(cè)定

利用大腸桿菌質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，將目的蛋白DNA序列導(dǎo)入大腸桿菌質(zhì)粒（5亞基分別轉(zhuǎn)入），培養(yǎng)該大腸桿菌，提取蛋白并進(jìn)行純化，然后利用SDS-PAGE測(cè)定蛋白純度。結(jié)果如下圖1，從圖中可以看出純化后膠圖由多條帶變?yōu)橐粭l帶，因此得到了高純度的表達(dá)蛋白。

圖1 表達(dá)的結(jié)核RNA聚合酶蛋白的SDS-PAGE試驗(yàn)

3.1 負(fù)染圖

將得到的蛋白進(jìn)行電鏡負(fù)染，得到了如下的結(jié)果。見(jiàn)圖2。由圖可知，顆粒形態(tài)為一個(gè)大的橢圓形顆粒延伸出一小顆粒結(jié)合的形狀，且大部分顆粒形狀相似，整體分散較均勻，濃度適中，有部分區(qū)域聚集，因此得到的蛋白純度單一，大小一致。

但是含有雜質(zhì)，需要進(jìn)一步再多做樣品確定是否適合做電鏡實(shí)驗(yàn)。

圖2 表達(dá)蛋白的電鏡負(fù)染結(jié)果

3.2 冷凍圖

進(jìn)行冷凍試驗(yàn)的電鏡觀察，得到如下的結(jié)果。見(jiàn)圖3。結(jié)果被初步揭示RNA聚合酶復(fù)合體的三維冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，但還不是很清楚，需要進(jìn)一步的觀察和篩選統(tǒng)計(jì)。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)表達(dá)了結(jié)核RNA聚合酶蛋白，并進(jìn)行了蛋白純化、SDS-PAGE檢測(cè)，以及負(fù)染電鏡和冷凍電鏡的觀察。初步學(xué)會(huì)了蛋白表達(dá)、純化的方法，及負(fù)染電鏡和冷凍電鏡的觀察等技術(shù)過(guò)程。在本實(shí)驗(yàn)中存在如下難點(diǎn)，有待今后實(shí)驗(yàn)解決。

圖3冷凍試驗(yàn)的電鏡觀察結(jié)果

4.1 如何確定五個(gè)亞基的均一性，我們初步考慮用復(fù)染進(jìn)行確定。4.2 表達(dá)蛋白不均一的解決辦法：初步考慮由交聯(lián)方法解決。4.3 冷凍制樣，蛋白小如何保證襯度和趨向：這個(gè)要控制影響因素，制樣條件很多，需要進(jìn)一步的摸索，包括放電、碳膜、吸附時(shí)間等等都要摸索出最優(yōu)化的條件。

4.3.1 放電條件判斷：設(shè)定一個(gè)放電的梯度，15s，20s，25s，30s，35s，40s控制其他因素不變，來(lái)摸索最優(yōu)的放電條件。初步確定30s最好。

4.3.2 碳膜選擇：可以對(duì)不同的GIG碳膜，quantifil碳膜(GIG)等進(jìn)行試驗(yàn)來(lái)選擇最好的。

4.3.3 蛋白吸附時(shí)間：設(shè)定一個(gè)放電的梯度，例如1s,2s,3s,4s，來(lái)摸索最優(yōu)的選擇是3s。

4.3.4 靶點(diǎn)：需要選擇合適的靶點(diǎn)，抑制的同時(shí)不影響人RNA（找與人相同位置差距大的靶點(diǎn)），然后確定酶活性中心、核酸出入口、核酸進(jìn)出通道等等。

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