異源表達(dá)TaEDR1抑制擬南芥edr1白粉病抗性

武廣珩，傅仙玉，鄧家耀，劉金仙*

（1.福建省生態(tài)產(chǎn)業(yè)綠色技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 武夷山 354300；2.武夷學(xué)院 生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建 武夷山 354300；3.武夷學(xué)院 茶與食品學(xué)院，福建 武夷山 354300）

白粉病是由白粉菌科（Erysiphacesae）真菌引起的植物病害。當(dāng)植物被侵染時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量由菌絲體、分生孢子梗和分生孢子構(gòu)成的肉眼可見(jiàn)的白色粉狀物，并由此而得名。白粉病在全世界分布廣泛，危害雙子葉植物，如葡萄、草莓、黃瓜等。同時(shí)它也侵染諸多的禾本科植物，如小麥、大麥、燕麥和多種牧草。其中小麥白粉病是由氣傳性?；纳婢际习追劬˙lumeria graminis）引起的真菌性病害，為世界各主要麥區(qū)的主要病害之一，且發(fā)病范圍日益擴(kuò)大，危害程度不斷加重，可引起13.4%～34%的產(chǎn)量損失[1]。白粉菌是高等植物的專性活體寄生菌，通常生長(zhǎng)在植物的表面，菌絲體表生或半內(nèi)生，以吸器進(jìn)入寄主細(xì)胞吸取養(yǎng)分，從菌絲上長(zhǎng)出直立的分生孢子梗，在梗端形成單生或成串的分生孢子。

擬南芥白粉病抗性相關(guān)基因EDR1基因編碼一個(gè)Raf樣MAPKKK蛋白激酶負(fù)調(diào)控水楊酸（Salicylic Acid，SA）誘導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)，edr1突變體表現(xiàn)出對(duì)白粉菌的抗性，以及病原菌誘導(dǎo)后比野生型積累更多的PR1轉(zhuǎn)錄本[2-3]。EDR1通過(guò)與MAPK級(jí)聯(lián)蛋白激酶MKK4和MKK5相互作用以及影響二者的蛋白表達(dá)水平來(lái)精確控制植物的免疫防衛(wèi)反應(yīng)[4]。KEG基因編碼一個(gè)包含環(huán)指結(jié)構(gòu)E3泛素連接酶結(jié)構(gòu)域和激酶域的蛋白，該基因的一個(gè)特異錯(cuò)義突變能夠抑制edr1的相關(guān)表型[5]。KEG與EDR1相互作用并招募EDR1在反式高爾基體和早胞內(nèi)體（TGN/EE）上定位[6]。KEG調(diào)控內(nèi)膜系統(tǒng)蛋白的運(yùn)輸，同時(shí)在白粉菌侵入的表皮細(xì)胞中發(fā)生特異性的降解[7]。EDR1還與另一個(gè)正調(diào)控植物免疫和細(xì)胞死亡的E3泛素連接酶ATL1在TGN/EE中相互作用；當(dāng)在擬南芥和煙草中過(guò)量表達(dá)ATL1導(dǎo)致植物出現(xiàn)細(xì)胞死亡的表型，并且這種細(xì)胞死亡能夠被EDR1抑制；而與此對(duì)應(yīng)的是，下調(diào)ATL1的表達(dá)能夠有效的抑制edr1介導(dǎo)的白粉病的抗病表型，以上這些暗示ATL1可能是EDR1潛在的底物[8]。近期研究發(fā)現(xiàn)，edr1的抑制子基因LLG1，編碼一個(gè)糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，與flg22識(shí)別受體FLS2互作，調(diào)控FLS2蛋白的積累及flg22誘導(dǎo)的FLS2降解，影響B(tài)IK1的磷酸化和活性氧的產(chǎn)生等，從而調(diào)控FLS2激活的免疫反應(yīng)[9]。

EDR1基因在在水稻和小麥的抗病中也表現(xiàn)出重要的作用。通過(guò)CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因定點(diǎn)編輯技術(shù)在普通小麥中創(chuàng)制的Taedr1基因編輯突變體同樣表現(xiàn)出對(duì)白粉菌的抗性，且無(wú)明顯的發(fā)育缺陷，驗(yàn)證了EDR1基因在小麥育種的應(yīng)用前景[10]。水稻OsEDR1的T-DNA插入突變體和RNAi轉(zhuǎn)基因植株對(duì)水稻白葉枯病菌黃單胞桿菌表現(xiàn)出抗性，在黃單胞桿菌和水稻的互作中，OsEDR1的表達(dá)促進(jìn)了乙烯的合成但抑制了水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）介導(dǎo)的抗性信號(hào)通路[11]。郭傳宇等研究還發(fā)現(xiàn)AtEDR1也參與擬南芥對(duì)稻瘟菌的非寄主抗性[12]。

為了進(jìn)一步研究EDR1蛋白的抗白粉菌機(jī)制，明確EDR1蛋白是否具有跨物種的功能保守性，本研究選擇研究較為清楚的小麥EDR1蛋白作為對(duì)象，構(gòu)建了TaEDR1基因的過(guò)量表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化了擬南芥edr1突變體，對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗病表型進(jìn)行了相關(guān)分析，為解析EDR1蛋白功能，以及為EDR1同源蛋白在其他經(jīng)濟(jì)作物中的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana）Columbia-0生態(tài)型 （Col-0）、pad4-1和edr1突變體，大腸桿菌DH5α，農(nóng)桿菌GV3101由本實(shí)驗(yàn)室保存。植物表達(dá)載體pBI-1.4t，白粉菌菌株Golovinomyces cichoracearum UCSC1和小麥品種KN199由福建農(nóng)林大學(xué)唐定中教授饋贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥的種植

擬南芥種子經(jīng)表面消毒和4℃春化處理三天，然后平鋪于在含有1%蔗糖的1/2 MS固體培養(yǎng)基上，種子萌發(fā)7 d后移植。對(duì)于觀察表型的植物和用于瞬時(shí)表達(dá)的煙草，需放置在9h光照、光照強(qiáng)度7 000～8 000 lx、相對(duì)濕度50%～60%和溫度21～24℃的溫室；對(duì)于收集種子的植物，我們將其放置在16 h光照、光照強(qiáng)度10 000～12 000 lx、相對(duì)濕度50%～60%和溫度21～24℃的溫室。

1.2.2 載體構(gòu)建

為了獲得35S-TaEDR1-pBI1.4t載體，我們使用Promega RNA提取與反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得小麥KN199幼苗（出芽5 d）的cDNA。以cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異引物 OE-F（CGCTCGAGATGAAGATCCCGTTTGTGACCAAGT，劃線部分為Xho I酶切位點(diǎn)）和OE-R（CCGTCGACATGTGCGGTTCACCGATATAAAGAT， 劃線部分為Sal I酶切位點(diǎn)）使用KOD plus（東洋紡）將TaEDR1完整CDS序列擴(kuò)增出來(lái)。擴(kuò)增程序：96℃預(yù)變性 5 min，95℃變性 10 s，68℃延伸3 min，68℃補(bǔ)充延伸5 min，30個(gè)循環(huán)。利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 （中科瑞泰）回收目的片段，插入克隆載體pEASY-Blunt Simple中（北京全式金生物公司），將測(cè)序驗(yàn)證后的序列通過(guò)Xho I和Sal I（大連寶生物公司）酶切后連入由CaMV35S驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體pBI1.4t中，進(jìn)行菌落PCR及雙酶切檢測(cè)，將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆。PCR引物合成及產(chǎn)物測(cè)序由上海生工生物公司完成。

1.2.3 遺傳轉(zhuǎn)化與純合體篩選

將上述含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌活化后，繼代培養(yǎng)至OD600=2.0，常溫3 200 g離心收集菌體，用等體積含0.03%SilwetL-77的5%蔗糖溶液重懸，使用2 mL吸管將重懸的菌液滴在擬南芥突變體edr1花上。暗培養(yǎng)24 h后放置于生長(zhǎng)室，在長(zhǎng)光照條件培養(yǎng)至種子成熟，得到T0代種子。將T0代種子在相應(yīng)抗性（卡那霉素，50 μg/mL）的不加蔗糖的MS平板上篩選，5～8 d后挑選轉(zhuǎn)化子，移苗到土中繼續(xù)培養(yǎng)。T1代轉(zhuǎn)化子用pBI1.4t載體篩選標(biāo)記基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ（Neomycin phosphotransferaseⅡ，NPTⅡ） 基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)計(jì)引物 NPTⅡ-F：5′-GGCTATTCGGCTATGACTGGGC-3′和 NPT Ⅱ -R：5′-GGCGATACCGTAAAGCACGAGG-3′PCR 驗(yàn)證，長(zhǎng)度 660 bp。 篩選得到的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，進(jìn)一步培養(yǎng)收獲轉(zhuǎn)基因種子。提取篩選到的陽(yáng)性植株T3代的葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄生成 cDNA，利用實(shí)時(shí)定量 PCR儀 （Eppendorf Realplex2）進(jìn)行擴(kuò)增（SYBR Premix Ex Taq Kit，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性90 s，95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)）。以擬南芥ACT2基因?yàn)閮?nèi)參，分別設(shè)計(jì)TaEDR1基因定量引物Q-TaEDR1-F：5′-GCTCATTGGCATTCAAGGGA-3′和 Q-TaEDR1-R：5′-GCATTGTCAGTGGCATTTCT-3′，內(nèi)參 ACT2 的引物 Q-ACT2-F：5′-AGTGTCTGGATCGGTGGTTC-3′和Q-ACT2-R：5′-CCCCAGCTTTTTAAGCCTTT-3′。 病程相關(guān)基因 PR1 引物：Q-PR1-F：5′-GTGGGTTAGCGAGAAGGCTA-3′和 Q-PR1-R：5′-ACTTTGGCACATCCGAGTCT-3′。

1.2.4 表型分析

Typan Blue染色：由于Typan Blue可以染色白粉菌的菌絲和分生孢子以及死亡的植物細(xì)胞。4周大小的擬南芥植物葉片接種保存于易感性突變體pad4-1上的白粉菌菌株Golovinomyces cichoracearum UCSC1；接種6 d后，采收葉片，將其置于Trypan Blue染液 （20 mL乙醇，10 mL苯酚，10 mL超純水，10 mL 83%乳酸和10 mg臺(tái)盼藍(lán)粉末）中煮沸2～5 min；染色后的葉片用水合三氯乙醛（2.5 g/ml）過(guò)夜脫色；用超純水洗滌三次后用50%甘油保存。依據(jù)Wang等[13]采用的方法，顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)獨(dú)立孢子形成的分生孢子梗的數(shù)目，隨后統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于基因型個(gè)體的表型記錄，則取接種8 d后的葉片進(jìn)行Typan Blue染色，使用光學(xué)顯微鏡（Leica DM2500）進(jìn)行觀察和拍照。

DAB染色：DAB可以染色白粉菌的侵染植物細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫（H2O2）。按一下步驟進(jìn)行：收集接種白粉菌48 h的葉片，將其置于DAB（1 mg/mL，pH=5.8）染液中染色12 h，隨后用無(wú)水乙醇脫色；用超純水洗滌三次后用50%甘油保存；使用光學(xué)顯微鏡（Leica DM2500）進(jìn)行觀察和拍照。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列檢索，利用Clustal omega軟件進(jìn)行序列比對(duì)，用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。使用Excel 2007對(duì)分生孢子梗計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 EDR1同源蛋白保守性

為了分析EDR1蛋白在植物中的保守性，我們對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中EDR1近緣蛋白進(jìn)行提取，利用Clustal Omega 軟件進(jìn)行比對(duì)分析（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）并通過(guò)MEGA7.0軟件構(gòu)建蛋白序列進(jìn)化樹(shù)。發(fā)現(xiàn)EDR1同源蛋白存在于單子葉和雙子葉植物中，并呈現(xiàn)較高的保守性（圖1A）。其中，不同物種中EDR1蛋白的激酶結(jié)構(gòu)域的一致性高達(dá)89.3%（圖1B）。

圖1 EDR1同源蛋白序列分析Figure 1 Sequence analysis of EDR1 homologous proteins

2.2 TaEDR1基因表達(dá)載體構(gòu)建

為了在擬南芥中異源表達(dá)小麥的TaEDR1基因，播種小麥KN199種子，生長(zhǎng)5 d后，收集新鮮葉片提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。利用特異性引物OE-F和OE-R擴(kuò)增長(zhǎng)度獲得了2896bp的TaEDR1 CDS編碼區(qū) （圖2A）。將 CDS序列連接到 pEASY-Blunt Simple克隆載體中，測(cè)序正確后用Xho I和Sal I雙酶切連接到pBI1.4t表達(dá)載體。將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體35S-TaEDR1-pBI1.4t轉(zhuǎn)化大腸桿菌并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，提取驗(yàn)證正確的菌落質(zhì)粒用Xho I和Sal I雙酶切鑒定，能夠切出目的片段，表明載體構(gòu)建成功（圖2B）。

圖2 TaEDR1 CDS表達(dá)載體的構(gòu)建Figure 2 TaEDR1 CDS expression vector constructed

2.3 異源表達(dá)TaEDR1抑制突變體edr1表型

通過(guò)農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)的浸花法將重組植物表達(dá)載體35S-TaEDR1-pBI1.4t轉(zhuǎn)入擬南芥突變體edr1，獲得16個(gè)具有T1代轉(zhuǎn)化子，PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)化子中的NPTII基因（660 bp），發(fā)現(xiàn)12個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株（圖3A）。此后，4周大小的12個(gè)T1代的轉(zhuǎn)基因植株、野生型和edr1接種白粉菌，8 d后發(fā)現(xiàn)T1代的轉(zhuǎn)基因植株、野生型各自的葉片上都有大量白粉菌菌絲和分生孢子梗的生長(zhǎng)，而edr1突變體僅有少量的菌絲和分生孢子梗，并出現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡。說(shuō)明擬南芥中異源表達(dá)TaEDR1基因能夠抑制突變體edr1的抗病表型（圖3B）。

圖3 異源表達(dá)TaEDR1抑制擬南芥edr1突變體白粉菌抗病表型Figure 3 Heterologous expression of TaEDR1 complementary edr1 mutant resistance phenotype

2.4 異源表達(dá)TaEDR1抑制突變體edr1中PR基因的表達(dá)和過(guò)氧化氫的積累

為了進(jìn)一步了解TaEDR1在擬南芥抗病反應(yīng)中的功能，我們將35S-TaEDR1-pBI1.4t遺傳轉(zhuǎn)化植株收種和分離鑒定，獲得T3代的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因株系。提取這些株系的RNA并合成cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TaEDR1在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)水平，選取表達(dá)量最高的OE-5進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖4A）。

為了明確TaEDR1在擬南芥中抑制edr1表型的能力，4周大小的野生型、edr1和轉(zhuǎn)基因植株OE5接種白粉菌。通過(guò)白粉菌在葉片表面的生長(zhǎng)觀察和白粉菌單個(gè)孢子上分生孢子梗生長(zhǎng)的定量計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)OE5和野生型無(wú)明顯差異，都明顯多于edr1突變體上生長(zhǎng)的分生孢子梗數(shù)，即表現(xiàn)出更加抗病的表型（圖4B、4C和4E）。此外，對(duì)4周大小的野生型、edr1和OE5進(jìn)行白粉菌接種，在48 h后取新鮮葉片進(jìn)行DAB染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體edr1在白粉菌接種48 h后，白粉菌孢子入侵點(diǎn)處出現(xiàn)大量過(guò)氧化氫積累，而Col-0和OE-5植物僅出現(xiàn)少量積累（圖4D）。

為了了解突變體中病程相關(guān)基因表達(dá)是否發(fā)生變化，對(duì)4周大小的野生型Col-0、edr1和OE5接種白粉菌，在接種后0、2、4 d收集葉片提取RNA、轉(zhuǎn)錄和對(duì)抗病相關(guān)基因AtPR1進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接菌前后Col-0和OE-5中AtPR1基因的表達(dá)都沒(méi)有明顯的差異；突變體edr1中AtPR1的表達(dá)接菌后2 d，較Col-0和OE-5已經(jīng)出現(xiàn)明顯的上調(diào)，在接菌后4 d，上調(diào)幅度已經(jīng)遠(yuǎn)大于Col-0和OE-5（圖4F）。

圖4 TaEDR1抑制擬南芥edr1突變體中白粉菌誘導(dǎo)的AtPR1基因的大量表達(dá)和H2O2的積累Figure 4 TaEDR1 inhibits the expression of AtPR1 gene and accumulation of H2O2in edr1 mutant

A：在12個(gè)T3轉(zhuǎn)基因植株中定量分析TaEDR1表達(dá)量，以AtACT2作為參照；B：4周大小的野生型、edr1和轉(zhuǎn)基因植株OE5，接種白粉菌后8 d的表型；C：Trypan Blue染色（B）中的葉片；D：對(duì)4周大小的野生型、edr1和轉(zhuǎn)基因植株OE5進(jìn)行白粉菌接種，48 h后取新鮮葉片進(jìn)行過(guò)DAB染色，褐色顯示過(guò)氧化氫的積累；E：定量分析野生型、edr1和轉(zhuǎn)基因植株OE5葉表面單克隆白粉菌形成分生孢子梗的數(shù)目。數(shù)據(jù)經(jīng)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，不同字母代表差異顯著。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，得到類似的結(jié)果（P＜0.01）；F：4 周大小的野生型、edr1 和轉(zhuǎn)基因植株 OE5 接種白粉菌，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)接種白粉菌后0、2、4 d的AtPR1的表達(dá)情況

3 討論與結(jié)論

植物在生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中可能會(huì)遭遇各種生物脅迫。以模式植物擬南芥為研究對(duì)象，人們通過(guò)鑒定和克隆對(duì)各種病原菌增強(qiáng)或減弱抗性的突變體，找到了很多基因參與了植物對(duì)病原微生物的防衛(wèi)反應(yīng)。EDR1基因作為一個(gè)抗病基因，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)其調(diào)控了植物（擬南芥、水稻和小麥）對(duì)真菌和細(xì)菌的抗性[2,10,11]。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)來(lái)自于不同單雙子葉植物的EDR1蛋白表現(xiàn)出很高的保守性，其抗性功能都表現(xiàn)出大量的過(guò)氧化氫和胼胝質(zhì)的積累，以及病程相關(guān)基因PR1表達(dá)的大幅度上調(diào)[4,10,12]。由此我們認(rèn)為EDR1是一個(gè)具有廣譜抗性的保守蛋白，在不同物種中發(fā)揮著類似的功能的基因。由此推測(cè)，不同來(lái)源的EDR1蛋白很可能能夠在不同物種中發(fā)揮同樣的功能。我們的結(jié)果證明了小麥的EDR1基因?qū)霐M南芥中，小麥EDR1蛋白可以在擬南芥中發(fā)揮功能，并且激發(fā)與AtEDR1類似的信號(hào)通路。EDR1蛋白在單雙子葉植物中大量存在、功能高度保守，為我們今后在其它經(jīng)濟(jì)作物中利用EDR1同源基因提高不同植物抗病性，乃至在分子設(shè)計(jì)育種中的利用，提供了堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。

此外，復(fù)雜農(nóng)作物物種的植物病理學(xué)研究由于缺乏相應(yīng)的研究體系，發(fā)展較為緩慢。利用模式植物擬南芥和相應(yīng)的突變體，與不同病原菌（假單胞桿菌、卵菌和白粉菌等）的植物病理研究系統(tǒng)的建立，將有利于復(fù)雜經(jīng)濟(jì)作物的抗病研究。