RP-HPLC法測(cè)定紅要子中大黃素的含量

宋若冰 張惠霞 董玉珍

紅要子為蓼科植物翼蓼Pteroxygonum giraldii Drammer et Diels.的干燥塊莖[1]。具有清熱解毒，涼血止血，收斂之功效。用于胃腸炎，菌痢、扁桃體炎，月經(jīng)不調(diào)，功能性子宮出血等。外用治外傷出血，燙火傷、癰疔等[2]?！吨兴幋筠o典》（第二版）下冊(cè)收載本品名稱(chēng)為“蕎麥七”，分布于河北、山西、河南、四川、陜西、甘肅等地，含蒽醌類(lèi)（大黃素、大黃素甲醚），鞣質(zhì)等化學(xué)成分。其中大黃素具有抑菌、抗炎、保護(hù)肝腎、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、抗癌等多種藥理作用[3]。本研究首次建立高效液相色譜法測(cè)定紅要子中大黃素的含量，為紅要子的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；METTLER TOLEDO電子分析天平（梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司，0.01 mg）；KQ-500型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋；大黃素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量測(cè)定用，含量以98.7%計(jì)，批號(hào)：110756-201512）；甲醇為色譜純，水為純凈水，其余試劑均為分析純；紅要子（河南省世通醫(yī)藥有限公司，選裝，每袋裝0.2 kg，產(chǎn)地：河南，批號(hào)：160415，160416，160417）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent C18（5μm，4.6×250 mm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液 （80∶20），流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫為30℃[4]。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取大黃素對(duì)照品10.86 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度0.1072 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。再取儲(chǔ)備液1 mL置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成濃度為4.29μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過(guò)四號(hào)篩）約4 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱(chēng)定重量，加熱回流1小時(shí)，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，置具塞錐形瓶中，水浴蒸干，加8%鹽酸溶液20 mL，超聲處理（功率100 W，頻率40 kHz） 5 min，加三氯甲烷20 mL，水浴中加熱回流1 h，取出，立即冷卻，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，洗液并入分液漏斗中，分取三氯甲烷液，酸液再用三氯甲烷液提取3次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得[4-5]。

2.4 系統(tǒng)性試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀中，記錄色譜峰。結(jié)果在對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間對(duì)應(yīng)的位置上，供試品溶液有色譜峰，理論板數(shù)按特大黃素峰計(jì)大于4000，分離度大于1.5，見(jiàn)圖1。

圖1 紅要子高效液相色譜圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2”項(xiàng)下濃度0.1072 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，配制濃度為1.07、2.14、4.29、8.58、12.86 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，分別精密吸取10μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積（mAU*s）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=77.28X+1.35，R=0.9999。結(jié)果表明大黃素在1.07～12.86μg·mL-1范圍內(nèi)線性良好。

2.5.2 精密度試驗(yàn)精密吸取“2.2”項(xiàng)下濃度為4.29μg·mL-1大黃素對(duì)照品溶液10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，RSD為0.15%，說(shuō)明儀器精密度良好。2.5.3重復(fù)性試驗(yàn) 取紅要子樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果RSD為0.37%，說(shuō)明重復(fù)性較好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，計(jì)算RSD為0.11%，表明溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品（批號(hào)：160415）9份，每份2 g，精密稱(chēng)定，分成3組，每組3份，每組分別加入“2.2”項(xiàng)下濃度為4.29μg·mL-1大黃素對(duì)照品溶液3 mL、5 mL、7 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別吸取10μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率均大于95%，RSD＜1.0%（n=3），符合定量分析的要求，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn) (n=3)

2.6 供試品含量測(cè)定 取紅要子樣品，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下濃度為4.29μg·mL-1大黃素對(duì)照品溶液、供試品溶液各10μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件注入液相色譜儀，記錄峰面積，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算供試品中大黃素含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)

3 討論

（1） 色譜條件的選擇參考《中華人民共和國(guó)藥典》 2015年版一部大黃含量測(cè)定項(xiàng)下色譜條件及相關(guān)文獻(xiàn)[4-5]，選擇甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相，以不同比例進(jìn)行調(diào)試，采用甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20） 為流動(dòng)相，所得大黃素色譜峰的理論板數(shù)高、峰對(duì)稱(chēng)性均較好，故選擇其作為流動(dòng)相。采用紫外分光光度計(jì)對(duì)大黃素對(duì)照品溶液于200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在254 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。（2）本方法簡(jiǎn)便快速、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，為紅要子藥材資源的開(kāi)發(fā)利用提供了一定的參考依據(jù)。

[1]河南省衛(wèi)生廳.河南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（二）[S].鄭州：中原農(nóng)民出版社，1993：43.

[2]河南省食品藥品監(jiān)督管理局.河南省中藥飲片炮制規(guī)范[S].鄭州：河南人民出版社，2005：65.

[3]張喜平，李宗芳.大黃素的藥理作用研究概況[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2003，19（8）：851-854.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典.一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：176.

[5]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典.一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：23.