結(jié)膜惡性黑色素瘤3例臨床病理分析及文獻復(fù)習(xí)

申發(fā)燕，張海萍，鐘山，白冬雨，張海芳，吳琴超

（廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，廈門 361003）

黑色素瘤是一種高度惡性腫瘤，是由于黑色素細胞異常增殖而形成，結(jié)膜的惡性黑色素瘤臨床較罕見，部分病例鏡下觀察缺乏黑色素，且病理形態(tài)多樣，因此診斷較困難，本文回顧性整理分析3例結(jié)膜惡性黑色素瘤的臨床及病理學(xué)特點，旨在提高對該疾病的認識水平。

材料與方法

1 材料

收集整理廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2012年1月～2018年5月診治的具備完整資料的3例結(jié)膜惡性黑色素瘤，同期惡性黑色素瘤175例，因此結(jié)膜惡性黑色素瘤占同期黑色素瘤的1.7%?；颊咂骄l(fā)病年齡65歲(范圍54～83歲)，其中男性2例，女性1例?；颊吲加醒奂t、異物感等臨床癥狀，無視力下降,其中1例伴出血、滲出（表1）。

表1 3例結(jié)膜惡性黑色素瘤的臨床資料Tab.1 Clinical data of 3 cases of conjunctival malignant melanoma

2 方法

送檢標本均用10%中性福爾馬林液固定，經(jīng)石蠟包埋，3μm厚組織蠟塊切片，然后HE染色，顯微鏡下觀察。免疫組織化學(xué)檢測均用全自動多功能組織病理檢測系統(tǒng)（Benchmark ULTRA）檢測（美國VENTANA公司），本實驗免疫組織化學(xué)檢測方法是Multimer AP Red，顯色系統(tǒng)為ultraVIEW Universal AP Red，一抗包括HMB-45、S-100、melan-A、cyclin D1、vimentin、CK、CD10、CD34、CD99、SMA、desmin、p53和Ki-67。以上一抗均購自福州邁新科技有限公司。步驟嚴格參照說明書進行，并設(shè)立已知的陽性對照及用PBS代替一抗的陰性對照，

結(jié) 果

1 大體檢查

3例結(jié)膜惡性黑色素瘤患者均進行局部腫瘤切除術(shù)，切除標本范圍均≤1cm，腫瘤大體呈結(jié)節(jié)狀，其中腫瘤的最大徑為0.7cm，浸潤皮下最深距離為0.3cm，腫瘤切面界限不清,呈灰黑、灰褐或暗紅色，質(zhì)地中等。

2 鏡下特點

病例1腫瘤細胞呈上皮樣型，細胞呈腺泡樣、巢團狀排列，巢團間見毛細血管增生，瘤細胞呈卵圓形，胞質(zhì)豐富、淡染，胞界不清，核稍大，核形不規(guī)則，部分胞核可見核溝，可見明顯核仁，并見病理性核分裂像，伴較多量色素沉著。病例2腫瘤累及表面鱗狀上皮，表皮伴破潰，見炎性纖維素性滲出，瘤細胞呈彌漫片狀浸潤性生長，瘤細胞呈梭形或長橢圓形，核大，核仁不明顯，部分胞核呈泡狀核，核分裂像多見，胞質(zhì)透亮、淡染，可見核周空泡，胞界不清，可見少量色素沉著，并可見少量壞死。病例3腫瘤細胞部分區(qū)域呈巢團狀的上皮樣型排列，部分區(qū)域呈席紋狀的梭形細胞排列，腫瘤累及表面鱗狀上皮，上皮樣型區(qū)域瘤細胞呈卵圓形，胞漿豐富、粉染，核大，核仁明顯，伴核偏位；梭形細胞型區(qū)域，瘤細胞呈長梭形，胞漿粉染，胞界不清，核分裂像可見，間質(zhì)較多量淋巴細胞為主炎細胞浸潤，可見較多量色素沉著（表2，圖1A-D）。

表2 3例結(jié)膜惡性黑色素瘤的病理資料Tab.2 Pathological data of 3 cases of conjunctival malignant melanoma

3 免疫表型

腫瘤細胞含有黑色素，因此本研究采用ultra-VIEW Universal AP Red顯色，陽性染色呈紅色，有助于陽性細胞觀察。免疫組織化學(xué)染色顯示：3例 HMB45、melanA、S-100、cyclinD1和 vimentin均為陽性，2例為p53陽性，3例Ki-67增殖指數(shù)25%～60%。病例2瘤細胞為梭形細胞，并且色素不明顯，為與其他間葉性腫瘤鑒別，加做CD10、CD99陽性，CK、CD34、SMA、Desmin均為陰性（表3及圖1E-H）。

圖1 結(jié)膜惡性黑色素瘤的HE染色及免疫組織化學(xué)染色。A，病例1腫瘤細胞呈上皮樣型，細胞核大，核仁明顯，并見黑色素沉著；B，病例2腫瘤細胞呈梭形細胞樣型，可見出血、滲出；C，病例3上皮樣區(qū)腫瘤細胞呈片狀排列，核呈卵圓形；D，病例3梭形細胞區(qū)腫瘤細胞呈席紋狀、旋渦狀排列；E，HMB-45腫瘤細胞彌漫陽性表達；F，Melan-A腫瘤細胞彌漫陽性表達；G，S-100 腫瘤細胞彌漫強陽性表達；H，Cyclin-D1腫瘤細胞彌漫強陽性表達；比例尺，50μmFig.1 HE staining and immunohistochemistry of conjunctival malignant melanoma. A, case 1 tumor cells were epithelial-like type, with large nuclei,obvious nucleoli, and melanin deposition; B, case 2 tumor cells show spindle-cell morphology, with hemorrhages and exudates; C, epithelioid tumor cells of case 3,which are arranged in patches, with an ovoid vesicular nucleus; D, spindle tumor cells of case 3, which are arranged in whorled and storiform; E, diffuse positive expression of tumor cells for HMB-45; F, diffuse positive expression of tumor cells for Melan-A ; G, diffuse strong positive expression of tumor cells for S-100; H, diffuse strong positive expression of tumor cells for Cyclin-D1; scale bar, 50μm

4 分子檢測結(jié)果

行BRAF V600E和c-Kit基因檢測，其中1例檢測出BRAF V600E基因突變，而未檢測出c-Kit基因突變（表3）。

表3 3例結(jié)膜惡性黑色素瘤的免疫組織化學(xué)及基因檢測結(jié)果Tab.3 Immunohistochemiscal and gene detection results of 3 cases of conjunctival malignant melanoma

5 隨訪

對該組3例患者通過電話隨訪，隨訪時間為術(shù)后3個月到5年，術(shù)后患者均未進行放化療等相關(guān)治療，現(xiàn)均未發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

討 論

惡性黑色素瘤是高度惡性腫瘤，是由黑色素細胞異常增殖而形成，皮膚是惡性黑色素瘤的常見部位，也可以發(fā)生于乳腺、食管、直腸、肛門和口腔等多個部位，眼的惡性黑色素瘤常發(fā)生于葡萄膜、結(jié)膜、眼周皮膚和眼眶等部位，葡萄膜惡性黑色素以脈絡(luò)膜最多見。結(jié)膜惡性黑色素瘤臨床相對罕見，約占眼部惡性腫瘤的2%。有文獻報道其發(fā)病率僅為千萬分之四，球結(jié)膜、角膜緣結(jié)膜和瞼結(jié)膜為相對好發(fā)部位[1,2]。

1 臨床特點

患者發(fā)病年齡在各個年齡段均有出現(xiàn)，但隨年齡增長發(fā)病率增高，以年齡較大者多見，60歲以上者占半數(shù)以上，而20歲以下者只占1%，男女差別不大，白種人較其他有色人種更易發(fā)病[3]。本組發(fā)病年齡為54歲、59歲和83歲，平均年齡65歲，本組男性患者多見（男2例，女1例）。結(jié)膜惡性黑色素瘤通常單側(cè)發(fā)生、邊界不規(guī)則、可見色素沉著，多數(shù)起自后天原發(fā)性的惡性黑色素瘤，少部分起自結(jié)膜色素痣，臨床表現(xiàn)為結(jié)膜緩慢增大的腫塊，初始約為小米粒大小，腫物處偶有眼紅、異物感，無視力下降，部分腫物可出現(xiàn)出血、滲出。本組病例其中2例起自后天的原發(fā)性惡性黑色素瘤，病史2個月到1年；1例患者結(jié)膜有色素性病變數(shù)十年，近期出現(xiàn)腫物2月，且緩慢增大，并且雙眼膜狀物生長4年，進行性生長，平素常出現(xiàn)眼紅、異物感。

2 病理特征

根據(jù)細胞形態(tài)特點，眼部的惡性黑色素瘤，可分為梭形細胞類型、上皮細胞類型和小細胞類型，其中梭形細胞類型預(yù)后最好，上皮細胞類型預(yù)后最差[4,5]。結(jié)膜的惡性黑色素瘤，一般體積較小，多小于1cm，大體一般為結(jié)節(jié)狀生長，腫瘤富于血管，切面多呈棕褐或灰黑色，部分可伴有潰瘍及滲出，腫瘤的界限一般不清楚。顯微鏡下觀察，腫瘤細胞形態(tài)多樣，部分呈束狀排列的長梭形細胞，部分呈巢團狀的上皮樣細胞，部分呈小細胞型或混合型。腫瘤細胞呈上皮樣型生長時，多排列呈巢團樣、腺泡狀或片狀，瘤細胞較大伴多形性，胞質(zhì)豐富、略嗜酸性，可見明顯的大紅核仁；腫瘤細胞呈梭形細胞型時，細胞的排列方式多為束狀排列或席紋狀排列，瘤細胞多呈長梭形或長橢圓形，細胞核多為空泡狀核，一般不易見大紅核仁，但可見多個小核仁；腫瘤細胞呈小細胞型時，瘤細胞呈彌漫片狀分布或散在分布，細胞小，核深染，胞漿少，可呈裸核樣，核仁不可見或僅見小核仁。以上各型均可見或不可見色素沉著，較易見核分裂像，可伴有壞死。本組研究病例以上皮樣類型、梭形細胞類型或二者混合型為主要鏡下形態(tài)。

3 免疫表型

惡性黑色素瘤通常以下免疫標志物可以彌漫陽性：HMB-45、melan A、S-100、vimentin、cyclin-D1和ki-67，其中HMB-45能特異性識別色素細胞和黑色素瘤細胞中的蛋白，可用于標記交界痣、藍痣、惡性黑色素瘤等；melan A是T細胞識別的黑色素瘤抗原基因的產(chǎn)物，在上皮樣惡性黑色素瘤中有較強的表達，在梭形細胞惡性黑色素瘤中表達會稍弱，同時在色素痣和色素細胞中也會表達；S-100蛋白也是黑色素細胞的標記物，常和HMB-45和melan A一起使用；vimentin在惡性黑色素瘤中通常也是陽性；cyclin-D1和ki-67主要用于良惡性黑色素腫瘤的鑒別，二者在惡性黑色素瘤中表達率均較高，且無隨病變深度遞減現(xiàn)象，ki-67增殖指數(shù)在惡性黑色素瘤中一般均大于10%。有些病例形態(tài)復(fù)雜，缺乏黑色素，為與其他腫瘤鑒別，可以加做CK，CD34，CD99，SMA，Desmin，Myogenin等指標；其中上皮性標記CK除了在癌中可以陽性外，在轉(zhuǎn)移性的惡性黑色素瘤中也可以出現(xiàn)陽性表達，而它在惡性黑色素瘤中的原發(fā)部位為陰性。

4 分子檢測

BRAF基因的單堿基突變是惡性黑色素瘤中最常檢測到的基因變異，該基因也是靶向治療的關(guān)鍵靶點，有學(xué)者報道我國惡性黑色素瘤BRAF基因的突變率約為25.5%,而其中大部分為BRAF(V600E)突變(89.1%)[6,7]，其他少見的突變位點還有V600K、V600R、V600D等[8]。國內(nèi)有文獻報道BRAF V600E和c-Kit的突變率均為7.7%，即在入組的13例病例中均發(fā)現(xiàn)各有1例發(fā)生V600E和c-Kit基因突變[9]。本組研究也檢測到1例發(fā)生了BRAF V600E基因突變，而c-Kit基因未檢測到突變。

5 鑒別診斷

發(fā)生于結(jié)膜的惡性黑色素瘤臨床較少見，且形態(tài)學(xué)復(fù)雜多變，對于無色素的惡性黑色素瘤診斷更加困難。注意與以下疾病鑒別：①結(jié)膜色素痣：多發(fā)生于瞼裂部的球結(jié)膜和角膜緣，是來源于神經(jīng)外胚層的良性腫瘤，色素痣的表面光滑、色彩均勻呈黑色，無潰瘍滲出，免疫組化ki-67增值指數(shù)一般＜10%。而惡性黑色素瘤患者年齡偏大，結(jié)節(jié)顏色不均一，邊界不規(guī)則，可出現(xiàn)潰瘍、滲出，有短期內(nèi)生長較快的病史，免疫組織化學(xué)ki-67指數(shù)一般＞10%；p53和cyclin D1可出現(xiàn)彌漫強陽性表達，并且隨病變加深，不出現(xiàn)遞減現(xiàn)象；melan A在良性痣細胞和惡性黑色素瘤中均可表達，但是在惡性黑色素瘤中，melan A可以隨著腫瘤厚度的增加、無瘤生存期的減少及死亡率的增加，而出現(xiàn)表達降低。②低分化鱗狀細胞癌：鱗狀細胞癌是結(jié)膜最常見的惡性腫瘤，它多發(fā)生于瞼緣皮膚和結(jié)膜的交界區(qū)、瞼裂區(qū)的角膜緣和內(nèi)眥部淚阜等部位，紫外線過度照射是其重要的誘發(fā)因素，惡性黑色素瘤部分呈上皮樣類型，與低分化鱗狀細胞癌都可以出現(xiàn)明顯核仁，特別對于無色素的上皮樣類型惡性黑色素瘤，需要行免疫組織化學(xué)進行鑒別，低分化鱗狀細胞癌P40、P63或CK5/6可呈一個或多個指標陽性，而HMB-45、melan A、S-100陰性。③分化差的肉瘤：惡性黑色素瘤形態(tài)多樣，細胞可呈梭形或多角形，部分細胞胞質(zhì)富粉染，胞核偏位，因此需與橫紋肌肉瘤鑒別，橫紋肌肉瘤腫瘤細胞myogenin、myogenin和MyoD1一般呈陽性表達，而S-100、melan A和HMB-45為陰性。有時瘤細胞呈束狀排列，細胞呈梭形或雪茄樣，需與平滑肌肉瘤鑒別，平滑肌肉瘤腫瘤細胞desmin和SMA呈陽性表達，而S-100、melan A和HMB-45為陰性。惡性黑色素瘤的肌源性標記均為陰性。

6 治療及預(yù)后

結(jié)膜的惡性黑色素瘤患者5年生存率約為22%，預(yù)后與多種因素相關(guān)，包括腫瘤的解剖學(xué)部位、浸潤的深度、累及的范圍，另外還與腫瘤的細胞類型、腫瘤單發(fā)還是多發(fā)、是否有原發(fā)性獲得性黑變病等有關(guān)；其中腫瘤的細胞類型中，梭形細胞類型預(yù)后較好，上皮樣細胞類型預(yù)后較差；出現(xiàn)壞死時預(yù)后差；當腫瘤的浸潤深度＞2 mm時，較易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[10]；解剖學(xué)位于球結(jié)膜及角膜緣的惡性黑色素瘤預(yù)后較好，而位于瞼結(jié)膜、穹隆部和淚阜的惡性黑色素瘤的預(yù)后較差，它可以侵襲眼球和眼眶，并且可以出現(xiàn)淋巴結(jié)和腦等其他部位的轉(zhuǎn)移。

治療上以手術(shù)切除為首選方法，推薦切除腫瘤邊界外4mm處結(jié)膜，并切除腫瘤下方薄的鞏膜瓣。病變僅累及結(jié)膜者，在徹底切除腫瘤后，在缺損區(qū)行羊膜移植術(shù)，如果腫瘤累及到角膜，需要徹底切除病灶，然后在角膜缺損區(qū)行板層角膜移植術(shù)。對于腫瘤累及范圍較局限的患者，治療成功的關(guān)鍵是進行早期腫瘤擴大切除術(shù)；而對于腫瘤累及范圍較廣的患者，可根據(jù)累及部位選擇眼球摘除術(shù)或者眶內(nèi)容物摘除術(shù)，受累淋巴結(jié)清掃術(shù)，冷凍、化療及免疫治療等多種治療方式[11]。

目前，除了外科手術(shù)切除外，術(shù)后的靶向治療效果也較顯著，針對惡性黑色素瘤BRAF基因突變的靶向藥物(vemurafenib等)，對患者有較好效果，與化療相比能夠顯著延長無進展生存期和總生存期[12]。

發(fā)生于結(jié)膜的惡性黑色素瘤較難引起患者的早期注意，因為它對視力影響較小，導(dǎo)致患者缺乏早期就診意識，掌握結(jié)膜惡性黑色素瘤的臨床特征及病理學(xué)特點，提高患者的早期就診意識，是提高患者預(yù)后生存的關(guān)鍵因素。