ERp29在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義

檀祝利，余 海，丁西平

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)我國(guó)2012年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，全國(guó)惡性腫瘤病例中，結(jié)直腸癌發(fā)病率位列第四，死亡率位列第五[1]。結(jié)直腸癌起病隱匿，患者早期多無(wú)明顯臨床癥狀，但腸道的血管及淋巴管分布較豐富，腫瘤易侵犯脈管系統(tǒng)出現(xiàn)浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致患者錯(cuò)失手術(shù)時(shí)機(jī)，預(yù)后差。結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展是多因素、多基因共同作用的結(jié)果，盡管經(jīng)過(guò)多年大量的臨床及基礎(chǔ)研究，但其內(nèi)在的發(fā)病機(jī)制仍未徹底闡明，還需要進(jìn)一步探索。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白29(endoplasmic Reticulum protein 29，ERp29)，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的特殊內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，其分子量為29 ku，各種組織均可表達(dá)。新近研究[2]表明，ERp29可發(fā)揮抑癌基因作用， ERp29的缺失或者突變可以導(dǎo)致人類腫瘤的快速生長(zhǎng)。到目前為止，ERp29在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚未完全明確，故研究ERp29在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其作用機(jī)制，對(duì)于分析ERp29在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中的作用，以及針對(duì)ERp29途徑的靶向性治療具有重要意義。

1 材料與方法

1.1組織標(biāo)本收集安徽省銅陵市人民醫(yī)院結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本共62例，每例標(biāo)本均選擇癌組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織蠟塊進(jìn)行切片并予ERp29免疫組化染色。所有患者術(shù)前未接受放療、化療或其他抗腫瘤治療。調(diào)閱對(duì)應(yīng)病歷記錄患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、T分期、腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等情況。

1.2免疫組化法全部結(jié)腸組織標(biāo)本均經(jīng)過(guò)中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，石蠟切片(Leica RM2135，厚度4 μm)，常規(guī)脫蠟至水。將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)予微波爐(美的W7022J)加熱至沸騰后斷電，間隔5 min后重復(fù)1次，冷卻至室溫，PBS 沖洗3次，每次5 min，加3%過(guò)氧化氫室溫靜置10 min，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加正常山羊血清封閉液室溫下封閉30 min，滴加1 ∶200稀釋后的ERp29單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)50 μl/片，4 ℃過(guò)夜，第2天取出室溫下復(fù)溫10 min，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，DAB染色5～10 min，在BX51型顯微鏡(日本奧林巴斯)下觀察把握染色程度，自來(lái)水沖洗10～15 min，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂膠封片，烤片，顯微鏡拍照，讀片，記錄染色結(jié)果，陰性對(duì)照用PBS代替一抗。

1.3結(jié)果判定ERp29免疫組織化學(xué)染色的判定以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為表達(dá)陽(yáng)性，并用以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)表達(dá)程度：著色強(qiáng)度評(píng)分：0分，無(wú)染色；1分，輕度染色；2分，中度染色；3分，重度染色。陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比評(píng)分：0分，陽(yáng)性細(xì)胞<5%；1分，陽(yáng)性細(xì)胞5%～25%；2分，陽(yáng)性細(xì)胞26%～50%；3分，陽(yáng)性細(xì)胞51%～75%；4分，陽(yáng)性細(xì)胞>75%。評(píng)分結(jié)果為著色強(qiáng)度評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分乘積，0～2分判定為陰性，2分以上為陽(yáng)性(2～4分為弱陽(yáng)性，5～8分為中等陽(yáng)性，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性)。免疫組化結(jié)果判定過(guò)程中由兩位高年資病理醫(yī)師分別評(píng)分，最后取平均得分記錄并統(tǒng)計(jì)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)在SPSS 22.0 版軟件下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。比較結(jié)直腸癌腫瘤組織和癌旁組織間ERp29免疫組化染色評(píng)分是否存在顯著性差異時(shí)，采用配對(duì)t檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。比較結(jié)直腸癌腫瘤組織和癌旁組織間ERp29染色強(qiáng)度是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異時(shí)，采用配對(duì)樣本的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。比較結(jié)直腸癌腫瘤組織中ERp29表達(dá)陽(yáng)性或陰性病例間，臨床資料及病理特征是否存在差異顯著性時(shí)，采用Pearson χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，當(dāng)某一項(xiàng)理論頻數(shù)存在1<理論頻數(shù)T≤5的情況時(shí)，采用連續(xù)校正的χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，當(dāng)某一項(xiàng)理論頻數(shù)存在理論頻數(shù)T≤1時(shí)，采用Fisher精確檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1ERp29在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)共搜集62例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本，每例標(biāo)本中癌組織及癌旁組織均行ERp29免疫組化染色，癌組織中棕黃色染色強(qiáng)度及范圍明顯低于癌旁組織(圖1)。讀片評(píng)分后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，癌組織組評(píng)分均值0.93，標(biāo)準(zhǔn)差1.01，癌旁組織組評(píng)分均值4.032，標(biāo)準(zhǔn)差2.044，62對(duì)數(shù)據(jù)行配對(duì)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.87，P<0.000 1)，癌組織ERp29表達(dá)陽(yáng)性24(38.70%)例,

圖1 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織ERp29的表達(dá) SP×400

A、C：ERp29在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)；B、D：ERp29在癌旁組織中的表達(dá)

癌旁組織58(93.50%)例(圖2)。對(duì)癌組織及癌旁組織ERp29不同表達(dá)強(qiáng)度構(gòu)成比進(jìn)行對(duì)比分析，無(wú)染色癌組織23例(37.10%)，癌旁組織5例(8.06%)；輕度染色癌組織30例(48.39%)，癌旁組織11例(17.74%)；中度染色癌組織8例(12.90%)，癌旁組織27例(43.55%)；重度染色癌組織1例(1.61%)，癌旁組織19例(30.65%), 癌組織中ERp29蛋白染色強(qiáng)度與對(duì)應(yīng)癌旁組織中ERp29蛋白染色強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-6.82，P<0.000 1)(圖3)。

圖2 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織ERp29表達(dá)差異統(tǒng)計(jì)

圖3結(jié)直腸癌組織與癌旁組織ERp29不同表達(dá)強(qiáng)度構(gòu)成比比較

-、+、、：無(wú)、輕度、中度、重度染色；與癌旁組織比較：***P<0.000 1

2.2結(jié)直腸癌ERp29表達(dá)與臨床及病理特征關(guān)系62例癌組織中ERp29表達(dá)陽(yáng)性24(38.70%)例，陰性38(61.30%)例，分為陽(yáng)性組和陰性組，再依據(jù)性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、T分期、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況判斷是否存在差異(表1)，采用χ2檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中不同ERp29表達(dá)水平時(shí)，腫瘤的TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

所有的真核細(xì)胞中均存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng),其是一種復(fù)雜的膜系統(tǒng)，由廣泛聯(lián)結(jié)的膜性管道結(jié)構(gòu)、囊或池構(gòu)成，可把不同的分子運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的不同位置或細(xì)胞表面[3-4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)含有大量具有蛋白合成和促成熟的分子伴侶，其中含有硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域的蛋白二硫鍵異構(gòu)酶樣蛋白質(zhì)，具有氧化還原、異構(gòu)酶及分子伴侶功能。ERp29可以使雙半胱氨酸模體結(jié)構(gòu)的活性中心失活，從而失去氧化還原活性[5]。ERp29在哺乳動(dòng)物組織中分布廣泛且表達(dá)豐富，其有N端和C端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，N端結(jié)構(gòu)域參與二聚化作用[5]，C端結(jié)構(gòu)域與底物結(jié)合以及分泌相關(guān)[6]。ERp29的蛋白分泌功能已經(jīng)在細(xì)胞水平進(jìn)行了充分研究[7]。在非折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)和將已合成的分泌蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體的過(guò)程中，ERp29均參與其中并扮演著重要角色[8]。已有相關(guān)研究報(bào)道ERp29在腫瘤中可以起到抑制性作用，并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了ERp29的抑癌作用，在胰腺導(dǎo)管腺癌[9]、乳腺癌、肺癌及膽囊癌中顯示腫瘤組織中ERp29的表達(dá)水平與腫瘤的進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)性[10]。但相關(guān)研究[11-13]顯示，ERp29可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)性，即ERp29可能發(fā)揮著促癌作用。因此，ERp29到底是發(fā)揮促癌作用還是抑癌作用尚存在一定的爭(zhēng)議[14]，不同狀態(tài)、不同環(huán)境、不同組織類型的腫瘤中ERp29的表達(dá)或許會(huì)有較大差異，因此本研究重點(diǎn)探討結(jié)直腸癌患者中ERp29表達(dá)與臨床特征的關(guān)系，以期為結(jié)直腸癌機(jī)制進(jìn)一步深入研究提供基礎(chǔ)。

表1 結(jié)直腸癌ERp29表達(dá)與臨床及病理特征的關(guān)系

注：*為校正χ2值；#為1≤理論頻數(shù)≤5

本研究中，針對(duì)62對(duì)結(jié)直腸癌患者的癌組織及癌旁組織均進(jìn)行了ERp29免疫組化染色，顯示癌組織中ERp29的表達(dá)陽(yáng)性率為38.7%，癌旁組織表達(dá)陽(yáng)性率為93.5%，癌組織中ERp29的表達(dá)水平明顯低于相應(yīng)癌旁組織，提示ERp29可能具有抑癌作用。進(jìn)一步分析24例癌組織中ERp29陽(yáng)性的病例發(fā)現(xiàn)，其染色強(qiáng)度多為輕度染色，而58例癌旁組織中ERp29陽(yáng)性的病例多為中度和重度染色，這進(jìn)一步說(shuō)明，ERp29表達(dá)水平的高低與腫瘤的某種惡性表型呈負(fù)相關(guān)性。隨后根據(jù)ERp29表達(dá)水平，將62例患者分為ERp29陽(yáng)性組和陰性組，兩組間年齡、性別、腫瘤?、分化程度、T分期的構(gòu)成比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ERp29陰性組的TNM分期III期及IV期的構(gòu)成比要高于陽(yáng)性組，陰性組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的構(gòu)成比要高于陽(yáng)性組。通過(guò)初步探討ERp29表達(dá)與臨床及病理特征的關(guān)系顯示，ERp29可能與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，當(dāng)ERp29表達(dá)下降時(shí)，腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲的能力可能會(huì)增強(qiáng)，但其間相互調(diào)控關(guān)系及內(nèi)在機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

近期關(guān)于胰腺導(dǎo)管腺癌的研究[9]顯示，ERp29表達(dá)水平下降時(shí)，胰腺導(dǎo)管腺癌患者腫瘤分期更晚，出現(xiàn)淋巴結(jié)浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的比率更高，預(yù)后更差，本研究結(jié)果與之類似。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能穩(wěn)態(tài)被打破后，常導(dǎo)致DNA損傷或氧化應(yīng)激狀態(tài)，易導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，ERp29在其中起著一定的作用，但其機(jī)制尚未明確[2]。其他相關(guān)研究[15]顯示，當(dāng)ERp29表達(dá)水平升高時(shí)，間質(zhì)上皮化水平也隨之顯著，上皮標(biāo)志物如E-cadherin、CK-19表達(dá)增加，間質(zhì)標(biāo)志物如波形蛋白和纖維連接蛋白表達(dá)水平下降。而上皮間質(zhì)化水平增加是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)的重要標(biāo)志，ERp29水平增高M(jìn)ET水平隨之增高則可逆轉(zhuǎn)EMT效應(yīng)，抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲的能力，所以，ERp29可能是通過(guò)影響EMT效應(yīng)來(lái)改變腫瘤細(xì)胞惡性表型，其具體內(nèi)在機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究顯示結(jié)直腸癌患者癌組織中ERp29的表達(dá)水平低于癌旁組織，ERp29表達(dá)水平越低，腫瘤TNM分期可能越晚，更易于發(fā)生轉(zhuǎn)移，ERp29的表達(dá)水平高低可為評(píng)估腫瘤轉(zhuǎn)移傾向及預(yù)后情況提供一定參考價(jià)值。

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