KCNQ1基因rs2237892多態(tài)性與合肥地區(qū)漢族人2型糖尿病的相關(guān)性

陳建豐，潘天榮

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的發(fā)病率在全世界范圍已越來越高，就中國范圍而言，就有超過1.096億的成年糖尿病患者和4.934億的糖尿病前期患者[1-2]。T2DM是一種受遺傳和環(huán)境因素的雙重影響的多因素代謝紊亂[3]，全基因組關(guān)聯(lián)研究識別出眾多基因與T2DM的發(fā)病、預(yù)后及疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[4-5]，例如KCNQ1、CDKAL1、TCF7L2、HNF4A、HNF1B和DUSP9等。KCNQ1 基因是電壓依賴性鉀離子通道家族成員之一，KCNQ1 基因突變可能導(dǎo)致遺傳性長QT綜合征，羅馬沃德綜合征和家族性心房纖顫[6]。KCNQ1基因也在胰島素生成細(xì)胞中表達(dá)，在大鼠胰島素瘤細(xì)胞中選擇性抑制KCNQ1通道能顯著增加胰島素分泌[7]，而在KCNQ1基因高表達(dá)的 MIN6細(xì)胞株中，通過葡萄糖，丙酮酸或甲苯磺丁脲刺激，均明顯導(dǎo)致胰島素分泌受損[8]。由此可見，KCNQ1可能參與糖尿病發(fā)病。

近年來中國、韓國、日本、新加坡、丹麥發(fā)現(xiàn)KCNQ1 多個單核苷酸多態(tài)性 與T2DM的易感性相關(guān)，但在不同種族之間存在差異[9-10]。該文研究安徽地區(qū)T2DM人群KCNQ1 rs2237892基因型分布以及與T2DM易感性的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1病例資料采用病例對照研究，選取2015年1月～2016 年11月在合肥市第二人民醫(yī)院收治的新診斷的T2DM的患者84 例，均為合肥地區(qū)的漢族居民，其中男50 例，女34 例，年齡45～76( 54.51±13.52) 歲。T2DM定義為：判定標(biāo)準(zhǔn)按照世界衛(wèi)生組織1999 年標(biāo)準(zhǔn)診斷，即糖尿病癥狀：如多飲、多食、多尿、體重減輕、視力下降、皮膚瘙癢等+隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L(200 mg/dl)；或空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)水平≥7.0 mmol/L(126 mg/dl)；或口服葡萄糖耐量實驗中，葡萄糖負(fù)荷后2 h血糖水平≥11.1 mmol/L(200 mg/dl)；癥狀不典型者，需另日重復(fù)檢查，予以證實[11]，且排除T1DM及其他代謝性疾病；選取體檢中心健康者(NC組)104 例，其中男58 例，女46 例，年齡44～75(51.25±11.18) 歲。既往無血糖異常史，排除胰腺炎病史、長期服用糖皮質(zhì)激素，并排除心、腦、腎疾病、自身免疫性疾病及惡性腫瘤史。兩組人群的年齡、性別、身高、體重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。所有研究對象在入組之前簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1臨床及生化檢查 所有研究對象空腹過夜，次日晨采集靜脈血測定FPG、總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triacylglycerol，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterin，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)。采用ELISA法測定空腹血清胰島素計算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)=[FPG(mmol/L)×空腹血清胰島素(mU/L)]/22.5。測量所有研究對象的身高和體重，計算體重指數(shù)(body mass index，BMI)。同時測量收縮壓(systolic blood pressure, SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)，測量腰圍、臀圍以計算腰臀比(waist/hip ratio，WHR)。

1.2.2基因分析方法 抽取所有研究對象空腹靜脈血5 ml，使用全血基因組DNA 小量快速提取試劑盒提取DNA，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)進(jìn)行基因分型分析，上游引物序列：5′-CTCAGAGGAAGAGCAAGGGTAG-3′，下游引物序列：5′-CCTGGGTCATCAGACTAGGG-3。DNA在以下設(shè)定條件中擴(kuò)增35個循環(huán)：94 ℃變性 30 s，51 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s。擴(kuò)增完成后，取擴(kuò)增的 PCR產(chǎn)物，加入限制性內(nèi)切酶Mbo Ⅱ在37 ℃下保溫3 h，取酶切產(chǎn)物10 μl置于2%的瓊脂糖凝膠上電泳，然后用凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄及分析結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0 進(jìn)行分析，NC組和T2DM組的臨床特點比較采用獨立樣本t檢驗或χ2檢驗，兩組基因型分布采用χ2檢驗，Hardy-Weinberg 平衡檢驗樣本的群體代表性，KCNQ1 rs2237892基因型與T2DM相關(guān)性采用Logistic 回歸分析、OR值(95%CI)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1KCNQ1基因rs2237892位點限制性酶切電泳圖使用限制性內(nèi)切酶對KCNQ1基因rs2237892位點進(jìn)行酶切。用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，如圖1所示，可見三種基因型，其分別為：TT變異純合基因型293 bp，CC野生純合基因型(72+221) bp，CT雜合基因型(72+221+293) bp。

圖1 PCR-RFLP技術(shù)分析KCNQ1 rs2237892的多態(tài)性

M：DNA Maker(100～500 bp)；1、2、5、6：CC野生純合基因型；4、8：TT變異純合基因型；3、7：CT雜合基因型；9：陰性對照

2.2兩組一般資料的比較兩組間年齡、性別、BMI、HDL-C、吸煙和飲酒比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。T2DM組的WHR、DBP、SBP、FPG、TC、TG、LDL-C、HbA1c和HOMA-IR明顯高于NC組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料的比較

2.3Hardy-Weinberg平衡檢驗本研究對T2DM組和NC組進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗，NC組χ2=0.943，P=0.331，T2DM組χ2=2.018，P=0.155，總體人群χ2=0.143，P=0.705，符合Hardy-Weinberg 平衡定律，表示樣本來自遺傳平衡的總體，具有群體代表性。NC組CC、CT、TT 基因頻率分別為54.81%、34.62%、10.57%，C、T等位基因頻率分別為65.48%、34.52%。T2DM組CC、CT、TT 基因頻率分別為40.48%、50.00%、9.52%，C、T等位基因頻率分別為72.12%、27.88%。兩組基因型及等位基因的構(gòu)成差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 rs2237892的基因型和等位基因分布情況[n(%)]

2.4KCNQ1基因rs2237892多態(tài)性與T2DM易感性的相關(guān)性調(diào)整肥胖、血壓 、血脂等協(xié)變量后，采用Logistic回歸分析顯示，KCNQ1 基因rs2237892 CT 基因型發(fā)生T2DM 的風(fēng)險較CC 型高0.44倍(P=0.02)，TT、CT+TT及CC+CT較CC基因型間危險度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

3 討論

T2DM是由環(huán)境和遺傳因素共同作用的代謝紊亂性疾病， 胰島素抵抗與胰島β細(xì)胞功能缺陷是其基本病理生理改變。但是T2DM的發(fā)病機(jī)制尚不明確，基因多態(tài)性也是目前研究的重點之一。

表3 rs2237892基因型對T2DM影響的Logistic回歸分析(n)

KCNQ1基因最早是由日本學(xué)者在2008年通過全基因組關(guān)聯(lián)分析方法得到的與T2DM的發(fā)病密切相關(guān)的候選基因，KCNQ1位于11p15.5，全長約404 120 bp，其編碼的電壓門控鉀通道蛋白，又稱KvLQT1，此蛋白在上皮組織的水、鹽,代謝及心臟動作電位的去極化過程中起到重要的作用[12]。Warth et al[13]發(fā)現(xiàn)KCNQ1和KCNE1基因在小鼠的腸道上皮細(xì)胞和胰腺外分泌細(xì)胞中高表達(dá)，其通過電壓依賴性通道緩地激活胰腺腺泡細(xì)胞的K+電流，間接調(diào)控胞質(zhì)Ca2+、降低通道的導(dǎo)電性，進(jìn)而調(diào)節(jié)小鼠胰腺外分泌細(xì)胞的分泌功能，這表明KCNQ1 基因在胰島素分泌中可能發(fā)揮著重要作用。

在本研究中，T2DM組和NC組在年齡、性別、BMI、HDL-C、吸煙和飲酒等方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義，然而，T2DM組顯示W(wǎng)HR、DBP、SBP、FPG、TC、TG、LDL-C、HbA1c和HOMA-IR明顯高于NC組。 Turki et al[14]的研究發(fā)現(xiàn)在土耳其阿拉伯人群中rs2237892 CT 基因型與T2DM 發(fā)病風(fēng)險增高密切相關(guān)(OR=2.11， 95%CI：1.25～3.53)；Cui et al[15]研究報道中國新疆哈薩克族女性患者rs2237892 位點T等位基因能夠增加T2DM的易感性，CT+TT基因型是T2DM的危險基因型；但Hu et al[9]發(fā)現(xiàn)rs2237892 位點C等位基因能夠增加T2DM的易感性。既往的研究[9,14-15]結(jié)果存在差異，考慮研究對象為不同的種族，可能rs2237892與T2DM的相關(guān)性存在地域的異質(zhì)性。鑒于既往研究結(jié)果不一致，本研究主要是針對合肥地區(qū)的漢族居民。本研究在合肥地區(qū)漢族人中顯示KCNQ1基因rs2237892 CT 基因型發(fā)生T2DM 的風(fēng)險為CC 型的1.44 倍(OR=1.44，95%CI：1.06～1.95)，是T2DM的易感基因型。

綜上所述，在合肥地區(qū)漢族人群中，KCNQ1 基因rs2237892 CT 基因型與T2DM發(fā)病風(fēng)險增加有關(guān)，推測KCNQ1可能是T2DM的易感基因之一。但本研究尚存在不足，如樣本量較小，可能會混淆分析。在今后的研究中需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，更深入地揭示KCNQ1基因與T2DM的發(fā)生，以及與并發(fā)癥之間的關(guān)系。

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