USPIO增強(qiáng)MRI在兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型的觀察研究

張 勇，李小鵬，徐智超，朱華慶，胡孝朋

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是一種由動(dòng)脈壁脂質(zhì)沉積引起的慢性血管病，而巨噬細(xì)胞在AS的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著核心作用，其積極參與動(dòng)脈壁的低密度脂蛋白的攝取和脂質(zhì)的積累，同時(shí)抗炎的巨噬細(xì)胞也與斑塊的穩(wěn)定性相關(guān)[1]。發(fā)現(xiàn)和分析AS斑塊的成分，評(píng)估其易損性對(duì)于心腦血管事件的診治有重要意義。目前對(duì)易損斑塊缺乏有效的、可重復(fù)性檢測(cè)技術(shù)，因而限制了對(duì)于斑塊特征性有價(jià)值的前瞻性研究的開(kāi)展。而超小順磁性氧化鐵(ultrasmall superparamagnetic iron oxide, USPIO)是一種新的磁共振增強(qiáng)成像劑, 本身具有被巨噬細(xì)胞吞噬的特性，使得USPIO增強(qiáng)磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)可用于顯示AS斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞，從而對(duì)AS早期斑塊情況作出診斷及評(píng)估。該研究擬通過(guò)建立兔動(dòng)脈粥樣易損斑塊模型，同時(shí)采用USPIO增強(qiáng)MRI檢測(cè)兔AS斑塊的形態(tài)和成分, 評(píng)估USPIO在AS斑塊檢測(cè)中的可行性，旨在為動(dòng)脈粥樣易損斑塊的早期發(fā)現(xiàn)、診斷提供相關(guān)理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制作所選動(dòng)物由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，選出30只健康的雄性新西蘭大白兔作為研究對(duì)象,體重1.6～2.0 kg。采用隨機(jī)分組法將動(dòng)物分為兩組(實(shí)驗(yàn)組20只，對(duì)照組10只)。AS兔模型采用高脂飼料喂養(yǎng)(高脂飼料成分比例為普通全營(yíng)養(yǎng)兔飼料79.5%、蛋黃粉15%、豬油5%、膽固醇0.5%)，而對(duì)照組只給予普通全營(yíng)養(yǎng)飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，每天100 g/kg，飲水不限，飼養(yǎng)16周后行血管彩超觀察斑塊情況，然后行磁共振檢查。所選動(dòng)物為SPF級(jí)動(dòng)物，所開(kāi)展實(shí)驗(yàn)已經(jīng)過(guò)當(dāng)?shù)貏?dòng)物關(guān)懷機(jī)構(gòu)同意，研究過(guò)程均遵守全國(guó)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)守則。

1.2主要試劑所用USPIO(Fe3O4磁性納米顆粒)購(gòu)自南京東納生物科技有限公司，具體規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)如下：Fe3O4內(nèi)核?約7 nm，水動(dòng)力尺寸(包括Fe3O4內(nèi)核+表面包覆層+表面水化層?)約35 nm。所用普魯士藍(lán)鐵染色試劑盒(Perls stain，伊紅法)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3血生化檢查及血管彩超于實(shí)驗(yàn)前及第16周分別對(duì)模型組及對(duì)照組經(jīng)耳緣靜脈抽空腹血5 ml，采用酶法測(cè)定血脂：血漿總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)，由全自動(dòng)生化儀檢測(cè)。第16周分別對(duì)模型組及對(duì)照組行腹主動(dòng)脈血管彩超，觀察斑塊情況。

1.4磁共振檢查

1.4.1麻醉方法 通過(guò)兔耳緣靜脈緩慢注射3%的戊巴比妥鈉溶液(1 mg/kg)進(jìn)行麻醉。

1.4.2MRI序列及相關(guān)參數(shù) 應(yīng)用3.0T MRI掃描儀，膝關(guān)節(jié)線圈。USPIO增強(qiáng)前、后掃描序列包括：AX 2D-TOF(回波時(shí)間5.4 ms，重復(fù)時(shí)間18 ms，翻轉(zhuǎn)角30°，層厚1 mm，矩陣512×512)；FSE T2W1(回波時(shí)間45.4 ms，重復(fù)時(shí)間5 058 ms，層厚4 mm，矩陣320×320)，PJN AX 2D-TOFLoc(回波時(shí)間5.4 ms，重復(fù)時(shí)間18 ms，翻轉(zhuǎn)角30°，層厚1 mm，矩陣512×512)，掃描腎動(dòng)脈上方5 cm及下方3 cm范圍內(nèi)的動(dòng)脈管壁。其后經(jīng)耳緣靜脈注入U(xiǎn)SPIO(0.1 mmol/kg)，再行磁共振增強(qiáng)掃描,每24 h重復(fù)一次,連續(xù)掃描5 d。

1.4.3圖像分析 觀察斑塊在不同序列上的信號(hào)情況, 測(cè)量T2WI上管壁信噪比(signal to noise ratio, SNR)，兩組進(jìn)行比較，連續(xù)觀察5 d，了解增強(qiáng)前后AS斑塊信號(hào)有無(wú)變化。

1.5病理檢查實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用靜脈空氣栓塞處死兩組動(dòng)物，解剖取出完整的腹主動(dòng)脈，后通過(guò)10%福爾馬林溶液進(jìn)行固定，對(duì)腹主動(dòng)脈組織標(biāo)本行橫斷切開(kāi)，大體上觀察判斷是否有AS。實(shí)驗(yàn)組以各個(gè)斑塊為中心取病理標(biāo)本，對(duì)照組在相應(yīng)范圍上取標(biāo)本作比較。對(duì)所有病理標(biāo)本實(shí)行鐵染色，在顯微鏡下觀察斑塊的相關(guān)特征以及鐵染色情況。

染色方法：① 切片脫蠟至水：二甲笨(I)5 min、二甲苯(II) 5 min、無(wú)水乙醇 5 min、95%乙醇 3 min、90%乙醇3 min、80%乙醇3 min、蒸餾水沖洗3 min；② 染色：切片入普魯士藍(lán)染色液15 min、蒸餾水充分沖洗5 min、伊紅染色液淡染細(xì)胞核15 s、自來(lái)水沖洗5 s；③ 脫水、透明、中性樹(shù)脂封固。

2 結(jié)果

2.116周后兩組血脂結(jié)果及實(shí)驗(yàn)組USPIO增強(qiáng)前后SNR值比較實(shí)驗(yàn)組TC(8.10±0.12)及TG(0.71±0.15)指標(biāo)較對(duì)照組TC(1.91±0.17)及TG(0.25±0.02)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組SNR值增強(qiáng)前后變化較大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組SNR值增強(qiáng)前后無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組增強(qiáng)前后SNR變化情況見(jiàn)圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)組USPIO增強(qiáng)前后SNR變化情況

2.2彩超結(jié)果16周時(shí)，血管彩超提示對(duì)照組管腔光滑，動(dòng)脈中膜連續(xù)呈高回聲影，而實(shí)驗(yàn)組彩超提示管腔局部狹窄，動(dòng)脈中膜增厚，局部有軟斑塊形成(圖2)。

2.3動(dòng)物模型病理檢查及MRI結(jié)果實(shí)驗(yàn)組20例中，共建模成功14例，血管彩超顯示模型組斑塊大部分位于腹主動(dòng)脈,對(duì)照組無(wú)明顯斑塊形成。通過(guò)病理標(biāo)本顯示對(duì)照組腹主動(dòng)脈管壁光滑完整，未見(jiàn)AS斑塊形成,鏡下可見(jiàn)動(dòng)脈內(nèi)膜薄厚基本一致，內(nèi)膜下未見(jiàn)泡沫細(xì)胞。鐵染色后顯示對(duì)照組兔腹主動(dòng)脈內(nèi)膜下無(wú)鐵顆粒存在。實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本上顯示腹主動(dòng)脈管壁較粗糙，內(nèi)膜凹凸不平，管腔表面可見(jiàn)多個(gè)斑塊(圖3)。鏡下顯示動(dòng)脈內(nèi)膜薄厚不一，局部增厚明顯，鐵染色后顯示斑塊內(nèi)有數(shù)量不等的藍(lán)紫色鐵顆粒沉積。在USPIO增強(qiáng)前、后，對(duì)照組在2D-TOF序列上顯示腹主動(dòng)脈管壁光滑完整，未見(jiàn)明顯管腔狹窄。實(shí)驗(yàn)組腹主動(dòng)脈管腔粗糙，2D-TOF序列上可見(jiàn)血管腔內(nèi)邊緣部的充盈缺損影，PJN-2DTOF序列上實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)管壁點(diǎn)狀充盈缺損，對(duì)照組血管壁光滑(圖4)。T2WI上可見(jiàn)局部管腔不同程度偏心狹窄，斑塊成圓形或弧形突向管腔，其內(nèi)稍高信號(hào)，USPIO增強(qiáng)后72 h顯示斑塊區(qū)管壁信號(hào)較前明顯減低，96 h后負(fù)性強(qiáng)化達(dá)峰值(圖5)。

圖2 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組血管彩超表現(xiàn)

A：對(duì)照組兔血管壁光滑；B：實(shí)驗(yàn)組兔向管腔內(nèi)突出的粥樣斑塊影，管腔局部狹窄，標(biāo)記處為斑塊所在

圖3 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組大體標(biāo)本圖

圖4 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組MRI序列及病理表現(xiàn)

A：對(duì)照組兔AX 2D-TOF序列；B：實(shí)驗(yàn)組兔AX 2D-TOF序列；C：對(duì)照組兔病理圖，鐵染色×40；D：實(shí)驗(yàn)組兔病理圖，鐵染色×100；E：對(duì)照組PJN 2D-TOF序列；F：實(shí)驗(yàn)組PJN 2D-TOF序列

圖5 實(shí)驗(yàn)組T2WI序列上信號(hào)變化

A：實(shí)驗(yàn)前可見(jiàn)白箭頭所示向管腔內(nèi)突出的纖維斑塊；B：USPIO增強(qiáng)96 h后白箭頭所示斑塊信號(hào)較前下降

3 討論

現(xiàn)有研究[2]顯示兔AS斑塊與人類AS斑塊在病理特征上具有相似性，故多選用兔來(lái)建立AS模型，而新西蘭大白兔目前應(yīng)用最為廣泛。而實(shí)驗(yàn)性兔AS模型建立的方法較多，最常用的為高脂飲食飼養(yǎng)結(jié)合球囊拉傷方法，也有單純高脂飲食飼養(yǎng)法，其中通過(guò)高脂飲食所建立的AS斑塊模型與人類血管疾病的發(fā)展特征相類似，但高脂飲食建模耗費(fèi)周期一般較長(zhǎng)，同時(shí)斑塊好發(fā)部分通常位于頸動(dòng)脈分叉，主動(dòng)脈弓或胸主動(dòng)脈等處，另外高脂飲食不同研究中的飼料配方也有不同，例如單純高膽固醇飲食或高膽固醇添加玉米油或高膽固醇添加豬油飼料等[2-4]。而本實(shí)驗(yàn)中，采用配方高脂飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，旨在探究單純高脂飲食建模的可行性，并估算所需周期，指導(dǎo)類似研究的開(kāi)展。實(shí)驗(yàn)中生化檢驗(yàn)提示兩組血脂存在顯著差異，實(shí)驗(yàn)組共有14例兔形成斑塊，后結(jié)合病理可見(jiàn)腹主動(dòng)脈的中下段可見(jiàn)較多斑塊，呈點(diǎn)狀或片狀分布，表明單純高脂飲食建立腹主動(dòng)脈AS模型是可行的，但仍有6例兔未能形成斑塊，同時(shí)這6例兔中有5例均出現(xiàn)體重較前減輕，可能系每天飼料進(jìn)食量不足或飼養(yǎng)周期不足所致建模失敗，綜合考慮單純高脂飲食16周左右可以成功建立兔AS斑塊模型。

AS在其病理進(jìn)展中，大量免疫細(xì)胞通過(guò)分泌促炎及抗炎等因子，影響其病理過(guò)程，而持續(xù)的炎癥又可加劇斑塊的不穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致了AS斑塊的破裂和臨床癥狀的發(fā)生，而巨噬細(xì)胞作為炎癥因子的主要來(lái)源和主要免疫細(xì)胞，在AS發(fā)生及進(jìn)展中有著關(guān)鍵的作用[5-6]。AS的早期病變中,由于多種細(xì)胞和趨化因子的引導(dǎo)作用, 單核細(xì)胞逐漸向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化,同時(shí)巨噬細(xì)胞參與調(diào)節(jié)模式識(shí)別受體，從而激活相關(guān)炎性反應(yīng)，促使泡沫細(xì)胞的形成與沉積，而隨著AS病變的發(fā)展，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎性因子也能夠刺激內(nèi)皮黏附分子、蛋白酶和其他調(diào)節(jié)分子的生成，促進(jìn)斑塊的形成、纖維帽的稀釋和壞死核心成分的稀釋，從而致使血栓的形成，斑塊的溶解，增加了斑塊不穩(wěn)定性，進(jìn)一步誘導(dǎo)AS的發(fā)生發(fā)展[7-8]。因此，通過(guò)巨噬細(xì)胞可開(kāi)展AS斑塊的早期研究。

USPIO本身存在兩個(gè)特性，第一，其在血液中保留時(shí)間長(zhǎng)達(dá)數(shù)小時(shí)；第二，組織中的巨噬細(xì)胞能特異性吞噬USPIO顆粒，前者在一定時(shí)間內(nèi)使血管保持較高的信號(hào)強(qiáng)度，后者使巨噬細(xì)胞成像成為可能[9]。而MRI血管壁成像結(jié)合相關(guān)技術(shù)，可以較直觀地反映AS斑塊成分、大小等重要特征，同時(shí)在評(píng)估易損斑塊的穩(wěn)定性方面，有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，多序列成像也可以幫助識(shí)別特定的斑塊的形態(tài)，如纖維帽，富含脂質(zhì)壞死核心，斑塊出血以及血管壁炎癥的跡象。而纖維組織在TOF序列上顯示為低信號(hào)，在T2WI上顯示為等或高信號(hào)，同時(shí)在纖維斑塊脂質(zhì)核心逐漸形成后，由于其主要中心成分是膽固醇及膽固醇酯，與脂類相比較，兩者的T2值明顯有所縮短，信號(hào)強(qiáng)度也衰減明顯，故在T2WI序列上顯示為低信號(hào)[10-12]。在本研究中，靜脈注入U(xiǎn)SPIO后，MRI上TOF序列的圖像信號(hào)在前2天內(nèi)未見(jiàn)明顯變化，在第4天AS管壁上信號(hào)明顯降低，同時(shí)信號(hào)變化區(qū)發(fā)生在斑塊形成處，AS斑塊中央高信號(hào)的脂質(zhì)核心區(qū)信號(hào)變化趨勢(shì)是先逐漸降低，其后又開(kāi)始回升，實(shí)驗(yàn)顯示巨噬細(xì)胞吞噬USPIO遵循一定時(shí)間規(guī)律，剛開(kāi)始需要一個(gè)緩慢的吞噬過(guò)程，同時(shí)巨噬細(xì)胞有一定的清除功能，能逐漸將USPIO顆粒清除。另外通過(guò)對(duì)比病理結(jié)果顯示，USPIO顆粒主要聚集分布在巨噬細(xì)胞內(nèi)，但在巨噬細(xì)胞間也有少量分布，而巨噬細(xì)胞主要位于內(nèi)膜下，考慮USPIO顆粒攝入過(guò)程中是首先通過(guò)內(nèi)膜，后大部分又被內(nèi)膜下巨噬細(xì)胞所吞噬，主要沉積在內(nèi)膜下。綜上，通過(guò)USPIO增強(qiáng)MRI能反映出巨噬細(xì)胞的聚集情況，可用于斑塊的檢測(cè)。

在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，本研究也存在一些問(wèn)題：① 由于實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)的影響，本實(shí)驗(yàn)圖像分辨率及圖片質(zhì)量有待提高；② 本實(shí)驗(yàn)MRI所得信號(hào)變化不如其他實(shí)驗(yàn)明顯，其可能原因是單純高脂飲食飼養(yǎng)周期仍不足或者造影劑劑量不足，延長(zhǎng)飼養(yǎng)周期或提高每日進(jìn)食量，增加造影劑劑量可能有助于實(shí)驗(yàn)改進(jìn)；③ 本實(shí)驗(yàn)樣本量較少，總體代表性有所不足，擴(kuò)大樣本量有助于實(shí)驗(yàn)改進(jìn)；④ 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，只在第16周行血管彩超及血脂檢查，不能精確評(píng)估斑塊形成最早時(shí)間，動(dòng)態(tài)觀察血管彩超及血脂變化將有助于估算單純高脂飲食所需建模周期；總之，進(jìn)一步的改進(jìn)實(shí)驗(yàn)，有望更精確地評(píng)估病變內(nèi)巨噬細(xì)胞的分布及聚集程度。

綜上所述，單純高脂飲食可以建立兔AS斑塊模型，靜脈注入U(xiǎn)SPIO 能被兔 AS 斑塊中巨噬細(xì)胞吞噬并導(dǎo)致斑塊MRI信號(hào)發(fā)生明顯變化，USPIO增強(qiáng)MRI可用于AS診斷及斑塊穩(wěn)定性評(píng)估。

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