胡桃醌通過(guò)PI3K/AKT途徑促進(jìn)前列腺癌LNCaP細(xì)胞氧化應(yīng)激

方 芳，陳 爽，張萬(wàn)生，方 青，王立國(guó)

目的探討胡桃醌對(duì)人前列腺癌LNCaP細(xì)胞的殺傷活性與其誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)性及機(jī)制。方法采用0、6.25、12.5、25、50和100 μmol/L胡桃醌作用前列腺癌LNCaP細(xì)胞，MTT法檢測(cè)不同劑量胡桃醌對(duì)LNCaP細(xì)胞生長(zhǎng)抑制影響；胡桃醌聯(lián)合抗氧化劑NAC作用細(xì)胞后，DCFH-DA作為熒光探針，用熒光酶標(biāo)法檢測(cè)活性氧(ROS)；胡桃醌聯(lián)合PI3K/AKT通路抑制LY294002作用細(xì)胞后，Western blot法檢測(cè)p-AKT、AKT和Nrf2蛋白表達(dá)變化。結(jié)果與陰性對(duì)照組比較，胡桃醌濃度在12.5 μmol/L或以上顯著抑制前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)(P<0.05，P<0.01)。胡桃醌能夠促進(jìn)細(xì)胞ROS含量(P<0.01)；胡桃醌聯(lián)合抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)導(dǎo)致ROS含量下降(P<0.05)，細(xì)胞存活率升高(P<0.01)。胡桃醌抑制p-AKT的表達(dá)，NAC能夠恢復(fù)胡桃醌抑制的p-AKT表達(dá)。胡桃醌能夠抑制細(xì)胞核Nrf2的表達(dá)，與PI3K/AKT抑制劑LY294002聯(lián)合使用進(jìn)一步抑制了Nrf2的表達(dá)。結(jié)論胡桃醌能夠抑制前列腺癌LNCaP細(xì)胞增殖，作用的機(jī)制可能與促進(jìn)ROS產(chǎn)生從而抑制PI3K/AKT途徑，導(dǎo)致Nrf2表達(dá)下降有密切關(guān)系。

胡桃醌；前列腺癌；ROS；PI3K/AKT；Nrf2；生長(zhǎng)抑制

胡桃醌是從胡桃楸的外殼中提取的一種活性成分，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，例如，前列腺癌、肺癌、卵巢癌等細(xì)胞，但具體機(jī)制不清[1-3]。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的DNA損傷能夠加速細(xì)胞的凋亡，具有抗腫瘤作用[4]。該研究在體外利用胡桃醌治療前列腺癌LNCaP細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞增殖、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)及其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，探討胡桃醌對(duì)人前列腺癌LNCaP細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑人前列腺癌LNCaP細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；進(jìn)口胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；RPMI 1640培養(yǎng)液和胡桃醌、N-乙酰半胱氨酸(NAC)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司； ROS試劑盒購(gòu)自南京碧云天生物科技公司；PI3K/AKT通路抑制LY294002、p-AKT(473)、AKT和Nrf2抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；β-actin抗體和辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1人前列腺癌LNCaP細(xì)胞株的培養(yǎng) 細(xì)胞采用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔日換液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，以2×104個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，加入分別為 100、50、25、12.5和6.25 μmol/L胡桃醌培養(yǎng)液，不加胡桃醌為陰性對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，體外繼續(xù)培養(yǎng)24 h。酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(A570)值。依下列公式計(jì)算LNCaP細(xì)胞的存活率：存活率(%) =胡桃醌組平均A570值/陰性對(duì)照組平均A570值×100%。

1.2.3檢測(cè)ROS 活性 NAC(0.5 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞60 min，然后加入25 μmol/L胡桃醌作用細(xì)胞24 h。加入無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋2′，7′-二氯熒光乙酰乙酸鹽( 2′，7′-dichlorofluoresceindiacetate，DCFH-DA) ，使其終濃度為5 μmol/L，37 ℃培養(yǎng)1 h，PBS 洗 3 次，酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.2.4Western blot法檢測(cè)p-AKT和Nrf2的表達(dá) 胡桃醌、LY294002(20 μmol/L)或胡桃醌聯(lián)合LY294002(20 μmol/L)作用細(xì)胞24 h后，提取細(xì)胞總蛋白或細(xì)胞核蛋白，蛋白定量后，加入2×上樣緩沖液，煮沸5 min。經(jīng)10% SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST洗膜，用含5%脫脂牛奶的TBST稀釋一抗(1 ∶3 000)，4 ℃過(guò)夜；TBST洗膜后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000)37 ℃孵育2 h，TBST洗膜，采用ECL發(fā)光液顯色，β-actin作為內(nèi)參照，使用Quantity One 軟件掃描并做灰度分析。

2 結(jié)果

2.1胡桃醌對(duì)LNCaP細(xì)胞生長(zhǎng)的影響終濃度為6.25、12.5、25、50和100 μmol/L的胡桃醌對(duì)LNCaP細(xì)胞的生長(zhǎng)活力具有抑制作用。與陰性對(duì)照組比較，胡桃醌濃度12.5 μmol/L以上，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度胡桃醌對(duì)LNCaP細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.2胡桃醌對(duì)ROS水平和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響與陰性對(duì)照組比較，終濃度為25 μmol/L的胡桃醌作用LNCaP細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞ROS水平顯著增高(P<0.01)。與胡桃醌組比較，胡桃醌聯(lián)合抗氧化劑NAC可降低ROS水平(P<0.05)，見(jiàn)圖2；與陰性對(duì)照組比較，胡桃醌抑制LNCaP細(xì)胞生長(zhǎng)(P<0.01)。與胡桃醌組比較，胡桃醌+NAC組細(xì)胞存活率增高(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

2.3胡桃醌對(duì)p-AKT、AKT和Nrf2蛋白表達(dá)的影響與陰性對(duì)照組比較，胡桃醌組p-AKT/AKT蛋白表達(dá)比例下降(P<0.01)；與胡桃醌組比較，胡桃醌與NAC聯(lián)合使用導(dǎo)致p-AKT/AKT蛋白表達(dá)比例升高(P<0.05)，見(jiàn)圖4。與陰性對(duì)照組比較，胡桃醌能夠抑制Nrf2的表達(dá)，胡桃醌和LY294002聯(lián)合使用進(jìn)一步抑制了Nrf2的表達(dá)，見(jiàn)圖5。

圖2 胡桃醌對(duì)LNCaP細(xì)胞的ROS作用

圖3 NAC拮抗胡桃醌抑制LNCaP細(xì)胞生長(zhǎng)作用

與陰性對(duì)照組比較：**P<0.01；與胡桃醌組比較：##P<0.01

圖4 Western blot檢測(cè)LNCaP細(xì)胞中p-AKT和AKT蛋白表達(dá)

與陰性對(duì)照組比較：**P<0.01；與胡桃醌組比較：#P<0.05

3 討論

近年來(lái)我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率有明顯的上升趨勢(shì)，一般采用激素、放療、化療等方法治療。但有些患者對(duì)化療藥物易產(chǎn)生耐藥[5]。我國(guó)的藥用植物資源豐富，已發(fā)現(xiàn)多種植物成分具有抗癌作用。人們很早就發(fā)現(xiàn)核桃楸樹(shù)皮及果皮具有抗腫瘤、抗炎和殺蟲(chóng)的作用，在中國(guó)許多治療癌癥的驗(yàn)方中都含有核桃楸成分。研究[6]顯示，核桃楸中這種具有抗腫瘤、抗炎及殺蟲(chóng)作用的有效成分是胡桃醌。課題組前期研究[1]結(jié)果表明，胡桃醌具有抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡的作用，但機(jī)制不清。

圖5 Western blot檢測(cè)LNCaP細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá)

與陰性對(duì)照組比較：*P<0.05；與胡桃醌比較：##P<0.01；與LY294002組比較：△△P<0.01

ROS是決定細(xì)胞生存狀態(tài)的重要物質(zhì)。適當(dāng)?shù)腞OS可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活，但如果細(xì)胞過(guò)度累積ROS是導(dǎo)致細(xì)胞損傷直至死亡的重要因素[7]。本研究結(jié)果表明，胡桃醌對(duì)LNCaP細(xì)胞具有抑制作用，并且呈劑量依賴關(guān)系；且經(jīng)胡桃醌刺激24 h后，LNCaP細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，應(yīng)用ROS抑制劑NAC能拮抗ROS水平及胡桃醌抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

PI3K/AKT信號(hào)途徑在腫瘤細(xì)胞中起著重要的調(diào)節(jié)作用，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、血管生成的作用。本研究表明，胡桃醌作用細(xì)胞后能夠抑制p-AKT的表達(dá)。在胡桃醌和NAC聯(lián)合處理LNCaP細(xì)胞后，p-AKT的表達(dá)水平增加。Nrf2是維護(hù)氧化還原平衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，尤其是在持續(xù)激活PI3K-AKT信號(hào)的條件下?；罨腜I3K-AKT通路增強(qiáng)Nrf2在核內(nèi)的積累，使Nrf2促進(jìn)具有抗氧化、抗炎、抗凋亡基因的表達(dá)[8-9]。本研究結(jié)果表明，PI3K/AKT途徑抑制劑LY294002能夠降低Nrf2的表達(dá)，胡桃醌與LY294002聯(lián)合使用進(jìn)一步抑制了Nrf2的表達(dá)。

綜上所述，筆者推測(cè)胡桃醌能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，具體機(jī)制可能與其促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞內(nèi)ROS異常積累，抑制PI3K/AKT途徑，導(dǎo)致Nrf2活性下降有密切關(guān)系。

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