局灶性腦缺血再灌注損傷對(duì)小鼠腦組織平滑肌細(xì)胞α-SMA表達(dá)的影響

陳二峰，談啟松，馬春春，卞爾保，趙 兵

α- 平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)是平滑肌最常用的標(biāo)志物，對(duì)平滑肌有比較高的特異性，敏感性也比較高。其主要功能包括：構(gòu)成細(xì)胞支架，維持細(xì)胞形狀；參與細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)的運(yùn)動(dòng)；介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞及參與蛋白質(zhì)的合成等，并與胞內(nèi)細(xì)胞器功能相關(guān)[1]。可見，α-SMA 是血管平滑肌細(xì)胞中重要的功能蛋白，其表達(dá)的變化對(duì)于提示血管平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變意義重大。已有文獻(xiàn)[2-5]報(bào)道各種致病因素導(dǎo)致的腎損傷、肝損傷、肺損傷、心肌損傷等組織損傷后α-SMA表達(dá)變化，但尚缺乏對(duì)腦損傷中平滑肌細(xì)胞α-SMA表達(dá)變化的研究。該研究通過對(duì)小鼠行右側(cè)大腦栓塞的方法制備小鼠局灶性腦缺血再灌注模型，通過免疫組織化學(xué)、Western blot及qRT-PCR等方法對(duì)比研究小鼠腦缺血2 h再灌注24 h后的小鼠(實(shí)驗(yàn)組)與假手術(shù)組和空白對(duì)照組的腦組織平滑肌細(xì)胞α-SMA的表達(dá)差異。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑清潔級(jí)成年雄性C57BL/6小鼠45只，體質(zhì)量18～25 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；水合氯醛購自上海白鶴化工廠；2′3′5′一氯化三苯基四氮唑(tripheny- Ltetrazolium chloride, TTC)購自美國Sigma公司；XTL-2400連續(xù)變倍顯微鏡購自上海精密儀器表有限公司；小鼠抗α-SMA多克隆抗體購自美國 Santa Cruz 公司；20 μl的反應(yīng)體系：10 μl 2×SYBR Green PCR Master Mix、7900型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；羊抗小鼠β-actin多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、兔抗羊IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Syngene Bio Imaging 檢測(cè)系統(tǒng)購自英國SYNGENE公司。

1.2方法

1.2.1分組 隨機(jī)將45只小鼠分為腦缺血再灌注組(實(shí)驗(yàn)組)、假手術(shù)組、空白對(duì)照組，每小組各15只。其中，實(shí)驗(yàn)組的小鼠缺血時(shí)間為2 h，再灌注時(shí)間24 h；假手術(shù)組小鼠手術(shù)只暴露游離頸總動(dòng)脈，不做栓塞處理；空白對(duì)照組小鼠正常飼養(yǎng)，不做特殊處理。各分組中6只用于備做TTC染色及梗死體積測(cè)定、免疫組織化學(xué)染色及檢測(cè)，另外9只用于提取腦組織蛋白做Western blot研究、提取mRNA做qRT-PCR分析。

1.2.2腦缺血再灌注模型制備 以Koizumi法為基礎(chǔ)制備腦缺血模型，小鼠用3.5%水合氯醛(0.08 ml/10 g)做腹腔注射麻醉后，在顯微鏡下充分暴露、分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery, CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery, ICA)和頸外動(dòng)脈(external carotid artery, ECA)，結(jié)扎ECA與ICA交匯處的ECA近心端和遠(yuǎn)心端，離斷ECA，可以清楚看見ECA深部的ICA，繞ICA穿線打一活結(jié)阻斷來自ICA上方的血流。饒CCA穿兩根線，近心端結(jié)扎，遠(yuǎn)心端不打結(jié)，在兩根線之間的CCA正中處剪一小口，插入頭端包裹硅橡膠的0.104 mm栓線(酒精并紫外線消毒后風(fēng)干)，解開ICA上活結(jié)，緩慢向ICA靠?jī)?nèi)、上、后方插入，一直到稍感有阻力為止，栓線進(jìn)深距CCA分叉處約7.5～9.0 mm，將頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入顱內(nèi)的主干道動(dòng)脈(主要是大腦中動(dòng)脈或大腦前動(dòng)脈)阻塞，結(jié)扎CCA遠(yuǎn)心端并固定栓線，插線完成即開始記錄缺血時(shí)間，縫合皮膚，線栓末端留在皮膚外。缺血2 h后拔除線栓以實(shí)現(xiàn)再灌注，縫合傷口。假手術(shù)組只做分離和暴露頸部血管而不做任何其他干預(yù)并縫合皮膚，待小鼠清醒后進(jìn)行Longa生物行為5分制評(píng)分，1～3分視為成功模型。再灌注24 h的模型組小鼠在麻醉狀態(tài)下，迅速開顱取腦。

1.2.3Longa生物學(xué)評(píng)分 0分：無任何神經(jīng)損傷癥狀；1分：提起小鼠尾巴時(shí)，出現(xiàn)左前肢內(nèi)收；2分：爬行時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，出現(xiàn)追尾動(dòng)作；3分：身體不穩(wěn)并向病灶左側(cè)傾倒，打滾、動(dòng)作緩慢；4分：不能行走或昏迷。其中1～2分視為輕度腦缺血，3分為中度腦缺血，4分為重度腦缺血，0分缺損極輕，4分缺損極重，均需剔除，而1～3分納入實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4TTC染色 所取腦組織置于-20 ℃速凍20 min，以2 mm厚度做冠狀切片，放入現(xiàn)配的0.5% TTC(磷酸緩沖液作為溶媒)中，于37 ℃恒溫水浴箱中嚴(yán)格密封、避光染色30 min，每隔10 min翻動(dòng)腦片1次使之均勻接觸染料，TTC染劑可以使正常腦組織染成紅褐色，缺血梗死灶出現(xiàn)蒼白色，然后將腦片放于4%多聚甲醛中固定2 h取出整齊擺放于藍(lán)色背景下并拍照，利用image J圖像分析軟件計(jì)算出梗死灶體積占整個(gè)大腦體積百分比。

1.2.5免疫組織化學(xué)染色 所取腦組織標(biāo)本置于4%甲醛溶液常規(guī)固定，石蠟包埋后制備5 mm厚石蠟切片，按照免疫組化常規(guī)步驟脫蠟水化、高壓修復(fù)，遵照試劑說明書精細(xì)準(zhǔn)確操作，牛血清稀釋液稀釋的抗 α-SMA抗體孵育4 ℃過夜，置于稀釋后的二抗中并室溫下孵育2 h，顯色劑中顯色、中性樹膠封片，組織切片置于顯微鏡200倍視野下觀察，胞質(zhì)顯示棕黃色α-SMA標(biāo)記陽性細(xì)胞，即周細(xì)胞。每張切片更換視野后拍攝照片。

1.2.6qRT-PCR分析 取各組小鼠右側(cè)大腦組織，按照常規(guī)提取RNA步驟提?。杭尤隩RIzol試劑后充分研磨、低溫離心、氯仿抽提、75%酒精洗滌、DEPC水溶解、RNA定量、稀釋、逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，加入α-SMA引物及SYBR進(jìn)行qRT-PCR分析。

1.2.7Western blot 取各組小鼠右側(cè)梗死大腦組織，加人PMSF細(xì)胞裂解液和RIPA混合液研磨，常規(guī)按總蛋白提取步驟標(biāo)準(zhǔn)：離心、取蛋白、煮沸，提取各組標(biāo)本的總蛋白，采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量。按順序制備SDS-PAGE凝膠(分離膠10%，濃縮膠5%)，按上樣量30 μg/20 μl上樣電泳(80 V、40 min，120 V、60 min)，硝酸纖維素膜濕轉(zhuǎn)(200 mA，60 min)，封閉液(含10%脫脂牛奶TBST封閉緩沖液)室溫封閉1 h，α-SMA抗體(大鼠抗小鼠，1 ∶500)4 ℃過夜，β-actin(大鼠抗小鼠，1 ∶1 000)4 ℃過夜，辣根酶標(biāo)記的IgG(羊抗大鼠，1 ∶10 000)室溫2 h，在暗室曝光顯色。

圖1 各組小鼠腦組織切片TTC染色結(jié)果

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)組小鼠缺血2h再灌注24h后Longa評(píng)分比較改良線栓法制備的局灶腦缺血小鼠模型再灌注24 h后進(jìn)行Longa生物學(xué)評(píng)分比較其神經(jīng)功能缺損情況。評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)結(jié)果顯示：空白對(duì)照組和假手術(shù)組小鼠無任何神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，評(píng)分均為0分，實(shí)驗(yàn)組小鼠Longa評(píng)分為2.33±0.72分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明實(shí)驗(yàn)組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯高于假手術(shù)組和空白對(duì)照組。

2.2腦梗死灶體積測(cè)量情況

2.2.1TTC染色情況 空白對(duì)照組小鼠腦組織全部紅染，無梗死灶，雙側(cè)大腦形態(tài)對(duì)稱、質(zhì)地均勻(圖1A)。假手術(shù)組小鼠腦組織基本全部紅染(圖1B)。實(shí)驗(yàn)組小鼠腦組織見右側(cè)腦皮質(zhì)區(qū)及紋狀體部分區(qū)域呈現(xiàn)出蒼白色，提示非完全梗死，局部見水腫嚴(yán)重(圖1C)。

2.2.2小鼠腦缺血梗死灶體積百分比分布情況 梗死灶體積百分比：空白對(duì)照組：0；假手術(shù)組：(0.50±0.50)%；實(shí)驗(yàn)組：(30.33±5.50)%。實(shí)驗(yàn)組腦梗死面積百分比明顯高于假手術(shù)組(F=3.951，P<0.05)。見圖2。

2.3qRT-PCR分析結(jié)果采用7900型熒光定量PCR儀測(cè)定每組DNA以α-SMA為引物的相對(duì)表達(dá)量；空白組：1；假手術(shù)組：1.07±0.04；實(shí)驗(yàn)組：2.45±0.14。以β-actin作為參照，實(shí)驗(yàn)組α-SMA的基因表達(dá)量高于假手術(shù)組及空白對(duì)照組(F=3.494，P<0.05)。見圖3。

2.4Westernblot結(jié)果采用Syngene Bio Imaging 檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定每組α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量，各組α-SMA蛋白條帶、參照物β-actin蛋白條帶顯影情況；空白對(duì)照組：1；假手術(shù)組：1.19±0.03；實(shí)驗(yàn)組：3.11±0.23。以β-actin作為參照，實(shí)驗(yàn)組α-SMA蛋白表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組(F=11.257，P<0.05)。見圖4。

圖2假手術(shù)組和實(shí)驗(yàn)組小鼠腦缺血梗死灶體積百分比分布情況

與假手術(shù)組比較：*P<0.05

圖3 各組小鼠腦缺血梗死區(qū)域中α-SMA蛋白對(duì)應(yīng)基因的相對(duì)表達(dá)情況

2.5免疫組化結(jié)果空白對(duì)照組小鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)α-SMA表達(dá)量甚少(圖5A)。假手術(shù)組小鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)α-SMA表達(dá)與空白對(duì)照組相似(圖5B)。實(shí)驗(yàn)組小鼠腦組織缺血皮質(zhì)區(qū)α-SMA表達(dá)相對(duì)空白對(duì)照組和假手術(shù)組明顯增多(圖5C)。

3 討論

構(gòu)建穩(wěn)定的模型是該實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素。本研究以Koizumi法為基礎(chǔ)制備腦缺血模型，由Koizumi于1986年首創(chuàng)[6]。該方法一般不開顱，相對(duì)易操作，對(duì)小鼠的損傷相對(duì)較小，對(duì)生理指標(biāo)影響也不大。此后線栓法在實(shí)驗(yàn)中通過不斷的改進(jìn)和完善，已成為目前應(yīng)用最廣泛的局灶性腦缺血模型造模方法。

圖4 各組小鼠腦組織α-SMA蛋白表達(dá)情況

A：Western blot檢測(cè)三組小鼠腦組織α-SMA、β-actin蛋白的表達(dá)；B：三組小鼠梗死側(cè)腦組織α-SMA蛋白的相對(duì)表達(dá)情況；1：空白對(duì)照組；2：假手術(shù)組；3：實(shí)驗(yàn)組；與假手術(shù)組比較：*P<0.05

圖5各組小鼠腦組織α-SMA免疫組化染色結(jié)果×200

A：空白對(duì)照組；B：假手術(shù)組；C：實(shí)驗(yàn)組

α-SMA是屬于肌動(dòng)蛋白家族的微絲。其是控制細(xì)胞形態(tài)的收縮肌特異性異絲氨酸蛋白酶和運(yùn)動(dòng)性，并且主要在血管中表達(dá)平滑肌細(xì)胞。另外，表達(dá)a-SMA與肌成纖維細(xì)胞相關(guān)[7]。血管平滑肌細(xì)胞存在于血管壁中膜，是血管壁的主要細(xì)胞成分之一，也是決定血管活性、血管構(gòu)型及維持血管張力的重要因素。肌動(dòng)蛋白是細(xì)胞骨架微絲的基本成分，其中α-SMA主要分布于肌肉細(xì)胞中，而特異性在血管平滑肌中表達(dá)的α-SMA是分化成熟的血管平滑肌細(xì)胞中含量最豐富的蛋白質(zhì)。因此，a-SMA可用來反映血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)數(shù)量及其收縮能力的改變，肌動(dòng)蛋白含量對(duì)VSMC的收縮能力具有巨大影響[8]。此外，α-SMA還與機(jī)體各種組織如心肌組織、肺組織、腎組織的成纖維化密切相關(guān)[2-5]。α-SMA在腎臟、皮膚、肌腱、心臟等損傷時(shí)有表達(dá)，其參與纖維化的發(fā)生發(fā)展，并與TGF-β1有關(guān)。在心臟損傷過程中，α-SMA還可通過血管生長(zhǎng)調(diào)節(jié)等途徑促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的生長(zhǎng)，從而參與冠心病的發(fā)生發(fā)展過程。在大量細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子作用下，成纖維細(xì)胞表達(dá)大量 α-SMA并分泌大量膠原蛋白，引起心臟纖維化。

同時(shí)也有大量研究[9-11]顯示：機(jī)體損傷后相應(yīng)組織高表達(dá)α-SMA，α-SMA的高表達(dá)通過對(duì)下游炎癥因子的調(diào)節(jié)而對(duì)組織和細(xì)胞起一定的保護(hù)作用。劉馨 等[9]通過對(duì)大鼠一側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血2 h，再灌注1～4 h后發(fā)現(xiàn)缺血組與空白對(duì)照組比較膠質(zhì)纖維酸性蛋白(神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特有標(biāo)記分子)表達(dá)無明顯變化，再灌注6～24 h，梗死中心區(qū)域及缺血半暗帶的膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)逐漸升高。本研究通過對(duì)小鼠實(shí)行再灌注24 h后進(jìn)行取樣分析，TTC染色中可以明顯看出實(shí)驗(yàn)組梗死區(qū)域水腫明顯，局部組織壞死嚴(yán)重。Hongo-Kohama et al[10]研究發(fā)現(xiàn)，在畸胎瘤血管系統(tǒng)中，α-SMA、CD31、鈣調(diào)結(jié)合蛋白和 Ki-67在血管平滑肌細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)含量可作為判斷血管平滑肌細(xì)胞成熟的指標(biāo)。炎癥細(xì)胞的趨化、游走和聚集主要通過肌動(dòng)蛋白纖維的伸展來實(shí)現(xiàn)。朱光明 等[11]在對(duì)大鼠腦內(nèi)小動(dòng)脈VSMC的表型轉(zhuǎn)化的研究中發(fā)現(xiàn)，再灌注損傷可以引起小動(dòng)脈VSMC表型轉(zhuǎn)化，當(dāng)VSMC為收縮表型時(shí)，α-SMA含量較多，細(xì)胞收縮功能強(qiáng)；而表型為合成表型時(shí)含量減少，細(xì)胞合成分泌功能占優(yōu)勢(shì)。其中絲蛋白和α-SMA在VSMC表型轉(zhuǎn)化中承擔(dān)著重要作用，其可能在再灌注中起著下調(diào)炎癥反應(yīng)及保護(hù)細(xì)胞的作用。

由此可見組織損傷后α-SMA表達(dá)的增高對(duì)機(jī)體的影響是一把雙刃劍。本研究表明缺血性再灌注腦損傷會(huì)刺激腦組織梗死灶平滑肌細(xì)胞表達(dá)α-SMA，而α-SMA在血管組織中的表達(dá)量對(duì)VSMC結(jié)構(gòu)和功能的改變意義重大[12-14]。其具體分子機(jī)制尚待研究。

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