丹皮酚逆轉(zhuǎn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡抵抗

范璐璐，孫國平，查麗霞，馬 泰

肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤，據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，全世界新發(fā)肝癌患者每年約 60 萬，居惡性腫瘤的第5位 ，肝癌因此被稱為“腫瘤之王”[1-2]。有文獻(xiàn)[3-4]報(bào)道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)誘導(dǎo)的凋亡抵抗是肝癌化療耐藥的重要原因之一，因此闡明肝癌凋亡抵抗的機(jī)制，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)新的干預(yù)手段提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，最終達(dá)到延長(zhǎng)患者生存期的作用。丹皮酚具有如解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等廣泛的藥理作用[5-6]。許多文獻(xiàn)[7-9]報(bào)道了丹皮酚有抗腫瘤作用，其殺傷腫瘤細(xì)胞的主要機(jī)制是誘導(dǎo)凋亡，為了探討丹皮酚在ERS誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞凋亡抵抗中的作用及機(jī)制，該研究首先通過觀察ERS誘導(dǎo)劑衣霉素(tunicamycin,TM)對(duì)人肝細(xì)胞(HL-7702)及肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的增殖抑制、凋亡差異及環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)蛋白表達(dá)的影響探討ERS凋亡抵抗的機(jī)制，通過使用丹皮酚觀察ERS下的HepG2肝癌細(xì)胞的增殖抑制、凋亡及COX-2蛋白表達(dá)影響，進(jìn)而探討丹皮酚逆轉(zhuǎn)ERS誘導(dǎo)的HepG2肝癌細(xì)胞凋亡抵抗的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑及藥物塞來昔布、MTT 購自美國 Sigma 公司；丹皮酚注射劑購自上海第一制藥廠；DMEM 培養(yǎng)基購自美國 Hyclone 生物公司；新生牛血清購自杭州四季青生物工程公司；原位末端凋亡檢測(cè)試(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)劑盒購自美國羅氏公司；兔抗人COX-2、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(78 kD glucose regulated protein，GRP78)抗體購自美國 Santa Cruz 公司；鼠抗人β-actin抗體、山羊抗兔、抗小鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2主要儀器EL301 Strip reader酶標(biāo)儀 (美國 Bio-Tek公司)；YJ-1450 型醫(yī)學(xué)凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備公司)； Image QuantTMLAS-4000 型發(fā)光成像系統(tǒng)(日本通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部)；DYY-10(ECP3000) 電泳儀(北京六一儀器廠)；倒置式顯微鏡(日本Olympus光 學(xué) 工 業(yè) 株 式 會(huì) 社)；Nacpo-6100 CO2培養(yǎng)箱(美國杜邦公司)。

1.3細(xì)胞系HL-7702人肝細(xì)胞株和HepG2人肝癌細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)方法 使用含10%血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，將細(xì)胞放置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 將1×104/L細(xì)胞接種于96孔板上，設(shè)置空白對(duì)照組和細(xì)胞對(duì)照組、不同藥物組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔接種200 μl細(xì)胞，置96孔板于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱24 h后，棄上清液，藥物組中每個(gè)孔加入使用200 μl DMEM稀釋的不同濃度的藥物，空白對(duì)照組和細(xì)胞對(duì)照組只加入200 μl的DMEM培養(yǎng)，在結(jié)束培養(yǎng)前4 h每孔加入20 μl MTT 5 g/L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清液，每個(gè)孔加入150 μl的 DMSO，使用EL301 Strip reader酶標(biāo)儀設(shè)定570 nm測(cè)定吸光值。按以下公式計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率：細(xì)胞的增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光值/細(xì)胞組吸光值)×100%。

1.4.3TUNEL 將1×105/L細(xì)胞接種于含有蓋玻片的6孔板中，置6孔板于37 ℃ 、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄上清液，加入不同濃度的藥物作用細(xì)胞24 h，取出6孔板中的蓋玻片，實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組，使用4%多聚甲醛固定30 min 后，按照TUNEL試劑盒說明書操作，使用DAB顯色及蘇木精染色后封片。在普通光鏡下觀察TUNEL染色標(biāo)本，隨機(jī)選取6個(gè)高倍視野，計(jì)算凋亡細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞的比例即為凋亡指數(shù)。

1.4.4Western blot法 將細(xì)胞加入裂解液裂解30 min后離心，吸取上清液并使用Lorry法定量后加入蛋白上樣緩沖液，將樣本放入沸水煮10 min后將標(biāo)本置于-20 ℃冰箱保存；實(shí)驗(yàn)經(jīng)過電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟后將標(biāo)本孵育一抗并放置于4 ℃冰箱過夜。次日，將標(biāo)本孵育二抗2 h再加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，利用發(fā)光成像系統(tǒng)顯像，以目標(biāo)蛋白/β-actin值反映目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1ERS誘導(dǎo)劑TM對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞和HL-7702肝細(xì)胞的增殖抑制及凋亡作用使用MTT法觀察不同濃度TM(1.5、3、6、9、12 μmol/L)分別作用于HepG2肝癌細(xì)胞和HL-7702肝細(xì)胞24 h的增殖抑制率(圖1)，結(jié)果顯示在TM誘導(dǎo)的ERS作用下肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制率并無明顯增加，3 μmol/L TM作用24 h增殖抑制率僅達(dá)到(22.7±4.1)%，而HL-7702正常肝細(xì)胞在相同濃度TM的作用下抑制率為(61.1±3.5)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-12.444，P<0.01)。采用TUNEL染色法觀察3 μmol/L TM分別作用于HepG2和HL-7702細(xì)胞24 h后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(圖2A、B)，結(jié)果顯示HepG2肝癌細(xì)胞組中，未使用TM處理的肝癌細(xì)胞組細(xì)胞增殖旺盛，僅見少許的凋亡細(xì)胞；而使用TM 作用24 h的HepG2肝癌細(xì)胞，僅見細(xì)胞密度稍減少和少量的凋亡細(xì)胞，凋亡率(15.2±2.3)%；而在HL-7702細(xì)胞組中， TM處理組的HL-7702細(xì)胞密度增加，胞凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加,凋亡率(57.2±5.6)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-12.201，P<0.01)，提示與正常HL-7702肝細(xì)胞相比，肝癌細(xì)胞HepG2對(duì)ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相對(duì)耐受。

圖1 TM誘導(dǎo)的ERS對(duì)HepG2和HL-7702細(xì)胞的增殖抑制率的影響

圖2 TM誘導(dǎo)的ERS對(duì)HepG2和HL-7702細(xì)胞凋亡的影響

A：TM作用于HepG2和HL-7702細(xì)胞的凋亡的形態(tài)學(xué)變化(TUNEL法×400)；B：TM作用于HepG2和HL-7702細(xì)胞的凋亡率；1：未處理HL-7702 組；2： TM 處理的HL-7702組；3：未處理HepG2組；4：TM 處理的HepG2組；與未處理組 HL-7702組比較：**P<0.01；與未處理HepG2組比較：##P<0.01；與TM處理的 HL-7702組比較：△△P<0.01

2.2ERS誘導(dǎo)劑TM對(duì)HL-7702肝細(xì)胞和HepG2肝癌細(xì)胞的COX-2蛋白和GRP78蛋白表達(dá)的影響使用 Western bolt觀察3 μmol/L TM作用于HL-7702肝細(xì)胞和HepG2肝癌細(xì)胞24 h后COX-2蛋白和GRP78蛋白表達(dá)的影響(圖3)，結(jié)果顯示在HL-7702肝細(xì)胞和HepG2肝癌細(xì)胞中ERS標(biāo)志性蛋白GRP78的表達(dá)均隨著TM作用時(shí)間的延長(zhǎng)而其表達(dá)逐漸增多，表明ERS的產(chǎn)生。同時(shí)顯示，肝癌細(xì)胞HepG2在TM的作用下COX-2蛋白的表達(dá)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而表達(dá)逐漸增加(P<0.05)，而在HL-7702細(xì)胞中， COX-2的表達(dá)并沒有相應(yīng)增多，表明ERS可誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞COX-2的表達(dá)，而不誘導(dǎo)正常肝細(xì)胞HL-7702 COX-2的表達(dá)。

2.3COX-2選擇性抑制劑塞來昔布對(duì)TM誘導(dǎo)的HepG2肝癌細(xì)胞的COX-2表達(dá)的及凋亡作用Western bolt法觀察10 μmol/L COX-2選擇性抑制劑塞來昔布加入TM處理的HepG2細(xì)胞24 h后COX-2表達(dá)的變化(圖4A)， 結(jié)果顯示TM誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞產(chǎn)生的COX-2可被塞來昔布抑制，采用TUNEL染色法觀察10 μmol/L COX-2選擇性抑制劑塞來昔布加入TM處理的HepG2肝癌細(xì)胞24 h后細(xì)胞凋亡的變化(圖4B、C)，結(jié)果顯示，與單獨(dú)使用TM組相比，塞來昔布加入TM處理的HepG2肝癌細(xì)胞后，細(xì)胞密度明顯減少，細(xì)胞凋亡率為(67.6±7.6)%(t=-11.418，P<0.01)。提示COX-2可能在ERS誘導(dǎo)的HepG2肝癌細(xì)胞凋亡抵抗中起重要作用。

2.4丹皮酚對(duì)ERS下的HepG2肝癌細(xì)胞的凋亡作用采用TUNEL染色法觀察31.25 mg/L丹皮酚加入TM處理的HepG2肝癌細(xì)胞24 h后細(xì)胞凋亡的變化(圖5A、B)，結(jié)果顯示，與單獨(dú)使用TM組相比，丹皮酚加入TM處理的HepG2肝癌細(xì)胞后，細(xì)胞密度減少，細(xì)胞凋亡率為(41.6±6.9)%(t=-4.647，P<0.01)，表明了丹皮酚可以逆轉(zhuǎn)ERS誘導(dǎo)的HepG2肝癌細(xì)胞的凋亡抵抗。

2.5丹皮酚對(duì)TM誘導(dǎo)的HepG2肝癌細(xì)胞COX-2表達(dá)的影響使用Western blot法檢測(cè)丹皮酚對(duì)TM誘導(dǎo)的HepG2肝癌細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)變化的影響(圖6)。結(jié)果顯示與未處理組相比，TM處理的肝癌細(xì)胞系HepG2 COX-2的表達(dá)明顯增高(P<0.01)，與TM組相比，使用丹皮酚明顯下調(diào)了ERS誘導(dǎo)的COX-2的表達(dá)(P<0.01)，表明丹皮酚可通過抑制COX-2逆轉(zhuǎn)ERS誘導(dǎo)的凋亡抵抗。

圖3 TM誘導(dǎo)的ERS對(duì)HL-7702肝細(xì)胞和HepG2肝癌細(xì)胞的COX-2蛋白和GRP78蛋白表達(dá)的影響

A：TM對(duì)HL-7702肝細(xì)胞的COX-2蛋白和GRP78蛋白表達(dá)的影響；B：TM對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的COX-2蛋白和GRP78蛋白表達(dá)的影響；與未處理HL-7702 GRP78蛋白的比較：*P<0.05；與未處理HepG2組GRP78蛋白的比較：##P<0.01；與未處理HepG2組COX-2蛋白的比較：△P<0.05，△△P<0.01

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞重要的膜性細(xì)胞器，其是細(xì)胞內(nèi)糖類、脂類和蛋白質(zhì)合成及修飾的場(chǎng)所。當(dāng)各種生理和病理因素造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡，可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白和未折疊蛋白增加、鈣離子濃度改變，從而誘導(dǎo)ERS的發(fā)生[10]。對(duì)于實(shí)體瘤，由于營養(yǎng)條件和血液供應(yīng)不足等因素的影響，可導(dǎo)致實(shí)體瘤內(nèi)存在低糖及低氧等應(yīng)激環(huán)境，從而損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常生理功能，繼而誘發(fā)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生ERS[11]。ERS可激活未折疊蛋白反應(yīng)，未折疊蛋白反應(yīng)一方面其在一定程度上能夠緩解ERS帶來的相關(guān)損害；另一方面如果ERS持續(xù)并且過度，那么未折疊蛋白反應(yīng)也可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。如果這種強(qiáng)ERS效應(yīng)發(fā)生在腫瘤細(xì)胞身上，則可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤的效應(yīng)。因此，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)ERS介導(dǎo)的凋亡的敏感性，是一種治療腫瘤的新策略。但有研究[12-13]指出，即使使用了ERS誘導(dǎo)劑，腫瘤細(xì)胞凋亡也并未有明顯的增多，這表明腫瘤細(xì)胞可對(duì)ERS產(chǎn)生適應(yīng)從而逃避凋亡。本研究也顯示與正常人肝細(xì)胞株HL-7702相比，人肝癌細(xì)胞株HepG2在TM誘導(dǎo)的ERS作用下細(xì)胞的增殖抑制作用及凋亡作用并不明顯，這一結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞HepG2對(duì)ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相對(duì)耐受。 目前關(guān)于其機(jī)制尚不清楚，因此闡明肝癌細(xì)胞ERS性凋亡抵抗的機(jī)制，通過新的干預(yù)手段提高肝癌對(duì)化療藥物的敏感性，最終達(dá)到延長(zhǎng)患者生存時(shí)間的作用。

圖4 塞來昔布對(duì)TM誘導(dǎo)的HepG2肝癌細(xì)胞的COX-2表達(dá)的影響及凋亡作用

A：塞來昔布對(duì)TM誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的COX-2表達(dá)的影響 ；B：塞來昔布作用于TM誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的凋亡形態(tài)學(xué)變化 (TUNEL法×400)；C塞來昔布作用于TM誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的凋亡率；1: 空白對(duì)照組;2 TM處理組;3：TM聯(lián)合塞來昔布處理組；與空白對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與TM處理組比較 ：##P< 0.01

圖5丹皮酚對(duì)ERS下的HepG2肝癌細(xì)胞的增殖抑制及凋亡作用

A：丹皮酚作用于TM誘導(dǎo)的HepG2肝癌細(xì)胞的凋亡形態(tài)學(xué)變化 (TUNEL法×400)；B：塞來昔布作用于TM誘導(dǎo)的HepG2肝癌細(xì)胞的凋亡率；1：空白對(duì)照組；2：TM 處理組；3：TM聯(lián)合Paeonol組；與空白對(duì)照組比較：**P< 0.01 ；與TM處理組比較：##P< 0.01

圖6 丹皮酚對(duì)TM誘導(dǎo)的HepG2肝癌細(xì)胞COX-2表達(dá)的影響

1：空白對(duì)照組；2：TM處理組；3：TM聯(lián)合Paeonol組；與空白對(duì)照組比較：**P<0.01；與TM處理組比較：##P<0.01

COX-2是前列腺素合成中的重要的限速酶，其在正常生理狀態(tài)下的多數(shù)組織中并不表達(dá)，但在細(xì)胞內(nèi)外刺激物(如內(nèi)毒素、細(xì)胞因子等)廣泛刺激下COX-2會(huì)迅速產(chǎn)生。研究[14-15]顯示COX-2可以促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、參與血管形成以及抵抗腫瘤細(xì)胞凋亡等，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。本研究顯示使用ERS誘導(dǎo)劑TM作用于HL-7702正常肝細(xì)胞株和HepG2肝癌細(xì)胞株，分別于0、6、12、24 h觀察COX-2的表達(dá)變化，表明COX-2蛋白在肝癌細(xì)胞中明顯增多，而在正常肝細(xì)胞中未見COX-2的表達(dá)明顯增加，當(dāng)加入COX-2選擇性抑制劑塞來昔布后肝癌細(xì)胞凋亡率上升，表明ERS 可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞COX-2的表達(dá)，進(jìn)而逃避了ERS介導(dǎo)的凋亡，抑制COX-2蛋白的表達(dá)可提高肝癌細(xì)胞HepG2對(duì)ERS性凋亡的敏感性，提示COX-2可能在ERS誘導(dǎo)的HepG2肝癌細(xì)胞凋亡抵抗中扮演著重要角色。

丹皮酚又稱為牡丹酚，是蘿摩科植物徐長(zhǎng)卿全草和中藥芍藥科植物牡丹根皮的主要成分[5-6]。許多文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道丹皮酚具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用。不僅如此，不斷有研究[9]表明丹皮酚有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。本研究顯示丹皮酚加入TM處理的HepG2肝癌細(xì)胞后，增殖抑制及凋亡均明顯增加，表明丹皮酚可逆轉(zhuǎn)ERS誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞凋亡抵抗。為明確丹皮酚是否通過抑制COX-2逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞對(duì)ERS誘導(dǎo)的抵抗，利用Western blot技術(shù)顯示丹皮酚可下調(diào)ERS誘導(dǎo)的HepG2肝癌細(xì)胞的COX-2的表達(dá)，其結(jié)果與使用塞來昔布結(jié)果相似，表明丹皮酚可通過抑制COX-2蛋白的表達(dá)繼而逆轉(zhuǎn)ERS誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡抵抗。

綜上所述，ERS誘導(dǎo)COX-2的產(chǎn)生可能是肝癌細(xì)胞HepG2抵抗細(xì)胞凋亡的原因之一，而丹皮酚可通過下調(diào)COX-2逆轉(zhuǎn)ERS誘導(dǎo)的HepG2肝癌細(xì)胞凋亡抵抗，從而深化了肝癌細(xì)胞對(duì)ERS性凋亡抵抗機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并為肝癌的治療提供新思路。

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