雌、孕激素聯(lián)合給藥逆轉(zhuǎn)miR-145對(duì)三陰性乳腺癌的抑癌作用

黃曉娟，何桂芳，尹 玉

隨著對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的深入研究，人們逐漸認(rèn)識(shí)到乳腺癌具有不同生物學(xué)行為的亞型。其中三陰性乳腺癌是Perou采用cDNA基因微陣列技術(shù)分析出的一類雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)、人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(human epithelial growth factor receptor 2，HER-2)三種蛋白均不表達(dá)的侵襲性乳腺癌。多發(fā)生于年輕女性，發(fā)病率約占乳腺癌的15%～20%[1]。目前關(guān)于三陰性乳腺癌的研究多為回顧性分析，對(duì)其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制知之甚少。研究[2-3]表明，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與體內(nèi)雌、孕激素水平的失衡密切相關(guān)，雌、孕激素水平的增高可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，激素替代療法(hormone replacement therapy，HRT)中聯(lián)合應(yīng)用兩種激素(雌激素和孕激素)療法的患者與單獨(dú)接受雌激素療法的患者相比，患乳腺癌的可能性更大。在激素受體陰性的情況下，雌、孕激素誘導(dǎo)三陰性乳腺癌發(fā)生的分子機(jī)制迄今為止仍未明了。

微小RNA(microRNAs, miRNAs)是一類長(zhǎng)度約18～23個(gè)核苷酸的非編碼RNA，在進(jìn)化上高度保守，通過(guò)與靶基因mRNA3′-UTR區(qū)域配對(duì)調(diào)控基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和發(fā)育、凋亡、細(xì)胞周期、增殖和分裂等生理病理過(guò)程[4]。miRNAs在多種腫瘤中出現(xiàn)特征性的表達(dá)種類和量的變化，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演著癌基因或者抑癌基因的角色[5-6]。研究[7]顯示miR-145在結(jié)腸癌、卵巢癌、肺癌等多種腫瘤中表達(dá)降低，包括三陰性乳腺癌。為此，該研究通過(guò)構(gòu)建MDA-MB-231/miR-145細(xì)胞株，檢測(cè)三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖能力以及miR-145靶基因胰島素樣生長(zhǎng)因子受體-1(insulin-like growth factor receptor-1，IGF-1R)、N-RAS及其下游信號(hào)分子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)水平，初步探討雌、孕激素在三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖的作用及相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2試劑 胎牛血清(杭州四季青公司)；胰酶細(xì)胞消化液(上海碧云天生物技術(shù)研究所)； CCK-8試劑盒(同仁化學(xué)研究所)；無(wú)水乙醇(北京化工廠)；17β-雌二醇、孕酮(美國(guó)Sigma公司)；N-RAS抗體、IRS-1R抗體 (美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；GAPDH抗體(上海康成生物科技有限公司)；羊抗兔、鼠二抗、ECL發(fā)光試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)；miR-145、U6引物及PCR逆轉(zhuǎn)錄和定量試劑(德國(guó)QIAGEN公司)。

1.1.3主要儀器 FC型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo electron corporation公司)；-70 ℃深低溫冰箱(日本SANYO公司)；高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；Thermal Cycler C1000 PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；Light Cycler480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)；光學(xué)顯微鏡(日本NIKON公司)，Tannon發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；TS-A型脫色搖床(上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231/miR-145和MDA-MB-231/miR-SCR(對(duì)照組)穩(wěn)定細(xì)胞株，分5組培養(yǎng)細(xì)胞，分別為miR-SCR組、miR-145組、miR-145+E2組、miR-145+P4組、miR-145+E2+P4組，分別分組給藥。

1.3CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況將細(xì)胞傳至96孔板，每孔1×103個(gè)細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔，每孔內(nèi)分別按劑量加藥:對(duì)照組為相應(yīng)劑量的無(wú)水乙醇，miR-145+E2組為含17β-雌二醇10 nmol/L的無(wú)水乙醇，miR-145+P4組為含孕酮100 nmol/L的無(wú)水乙醇，miR-145+E2+P4組為含17β-雌二醇10 nmol/L和孕酮100 nmol/L的無(wú)水乙醇。置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后向培養(yǎng)板中加入CCK-8溶液，每孔10 μl，置于培養(yǎng)箱內(nèi)再孵育4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度值。連續(xù)5 d在同一時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.4Westernblot法檢測(cè)IGF-1R、N-RAS的表達(dá)水平培養(yǎng)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-145的三陰性乳腺癌細(xì)胞，給藥6 h后，裂解各組細(xì)胞，常規(guī)方法提取蛋白，測(cè)定其蛋白濃度；配制SDS-PAGE凝膠，電泳，轉(zhuǎn)膜；5%脫脂牛奶封閉1 h;一抗(1 ∶1 000)室溫作用1 h；PBS/T沖洗3次，每次10 min；二抗(1 ∶5 000)室溫水平搖床作用2 h；PBS/T沖洗3次，每次10 min；采用辣根過(guò)氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法顯色。通過(guò)與內(nèi)參GAPDH的條帶光度值的比值間接反映IGF-1R、N-RAS的表達(dá)水平。

1.5qRT-PCR法檢測(cè)VEGF和miR-145的表達(dá)水平收集轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞，按TRIzol試劑說(shuō)明書提取總RNA，根據(jù)VEGF及內(nèi)參GAPDH的基因序列分別設(shè)計(jì)并合成引物，VEGF上游引物：5′-TCGGGCCTCCGAAACCATGA-3′，下游引物：5′-CCTGGTGAGAGATCTGGTTC -3′。GAPDH上游引物：5′- CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3′，下游引物：5′-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC -3′。分別取1 μg總RNA做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄后再取1 μg反應(yīng)液作為熒光定量的模板。反應(yīng)條件為95 ℃、5 min, 95 ℃、1 min，59 ℃、40 s,72 ℃、30 s,35個(gè)循環(huán)。miR-145利用特異性頸環(huán)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)引物，U6為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:95 ℃、30 s, 95 ℃、5 s, 60 ℃、30 s, 72 ℃、10 s，40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCT法計(jì)算VEGF和miR-145相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1MDA-MB-231/miR-145及MDA-MB-231/miR-SCR穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建本研究構(gòu)建的慢病毒載體上帶有紅色熒光RFP，同時(shí)帶有嘌呤霉素抗性，感染慢病毒的細(xì)胞用嘌呤霉素篩選后能夠存活。熒光顯微鏡下觀察顯示，感染率幾乎達(dá)100%，表明穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建成功。見(jiàn)圖1。

圖1 熒光顯微鏡下觀察MDA-MB-231/miR-145及MDA-MB-231/miR-SCR穩(wěn)定細(xì)胞株的感染情況 ×100

A:紅色熒光視野；B：明視野；1：MDA-MB-231/miR-145細(xì)胞株；2：MDA-MB-231/miR-SCR細(xì)胞株

2.2轉(zhuǎn)染后miR-145表達(dá)上升qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與miR-SCR組相比，轉(zhuǎn)染后miR-145組miR-145的表達(dá)水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.034,P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3雌、孕激素及mi-145對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響CCK-8試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-SCR組相比，miR-145組、miR-145+E2組、miR-145+P4組細(xì)胞增殖均顯著下降，從檢測(cè)第3天起至第5天差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.37，P<0.01；t=10.80，P<0.01；t=16.85，P<0.01)、(t=9.913，P<0.01；t=7.099，P<0.01；t=13.640，P<0.01)、(t=13.73，P<0.01；t=6.270，P<0.01；t=11.70，P<0.01)；miR-145+E2+P4組細(xì)胞增殖從檢測(cè)第3天起至第5天差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與miR-145組相比較，miR-145+E2+P4組細(xì)胞增殖明顯上升，從檢測(cè)第3天起至第5天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.656，P<0.01；t=12.040，P<0.01；t=14.470，P<0.01)；與miR-145+E2組相比較，miR-145+ E2 +P4聯(lián)合作用組細(xì)胞增殖明顯上升，從檢測(cè)第3天起至第5天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.782，P<0.05；t=6.530，P<0.01；t=11.480，P<0.01)；與miR-145+P4組相比較，miR-145+ E2 +P4聯(lián)合作用組細(xì)胞增殖明顯上升，從檢測(cè)第3天起至第5天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.041，P<0.01；t=5.749，P<0.01；t=9.709，P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖2 MDA-MB-231/miR-145及MDA-MB-231/miR-SCR穩(wěn)定細(xì)胞株轉(zhuǎn)染后miR-145的表達(dá)情況

圖3 雌、孕激素及mi-145對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響

2.4IGF-1R、N-RAS蛋白的表達(dá)Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示：與miR-SCR組相比，miR-145組、miR-145+E2組、miR-145+P4組IGF-1R蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)(t=6.453，P<0.01；t=5.203，P<0.01；t=9.774，P<0.01)；N-RAS蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)(t=5.563，P<0.01；t=6.438，P<0.01；t=5.998，P<0.01)；miR-145+E2+P4組IGF-1R、N-RAS蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖4。

圖4 IGF-1R、N-RAS在各組的表達(dá)

A:IGF-1R; B:N-RAS; 1:miR-SCR組; 2:miR-145組; 3:miR-145+E2組; 4:miR-145+P4組; 5:miR-145+E2+P4組;與miR-SCR組比較：**P<0.01

2.5VEGF的表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與miR-SCR組相比，miR-145組VEGF的表達(dá)水平顯著下調(diào)(t=16.34，P<0.01)；與miR-145組相比，miR-145+E2組、miR-145+P4組、miR-145+ E2+ P4組VEGF的表達(dá)水平顯著上升(F=52.12，P<0.01)。見(jiàn)圖5。

3 討論

近年來(lái)，miRNA作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要調(diào)控因子，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的關(guān)系越來(lái)越受到關(guān)注[8]。miRNAs的表達(dá)受雌激素或孕激素的調(diào)控，近年來(lái)在細(xì)胞和動(dòng)物中均有報(bào)道。Li et al[9]在子宮內(nèi)膜組織中檢測(cè)miRNAs及其靶基因的表達(dá)，結(jié)果顯示與正常對(duì)照組相比，高血清孕酮組4種miRNAs水平顯著下調(diào)。本研究中qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與miR-SCR組相比，轉(zhuǎn)染后miR-145組miR-145的表達(dá)水平顯著上調(diào)，結(jié)合CCK-8試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-145組細(xì)胞增殖明顯下降，這與Sempere et al[7]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，提示miR-145可抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖；而與miR-SCR組比較，miR-145+E2+P4組細(xì)胞增殖無(wú)明顯差異，提示雌、孕激素聯(lián)合用藥可逆轉(zhuǎn)miR-145對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖作用。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-145組IGF-1R、N-RAS蛋白表達(dá)水平下調(diào)，miR-145+E2組和miR-145+P4組IGF-1R、N-RAS蛋白表達(dá)水平也下調(diào)，而miR-145+E2+P4組表達(dá)上升，提示雌、孕激素聯(lián)合給藥作用于三陰性乳腺癌細(xì)胞可逆轉(zhuǎn)miR-145靶基因IGF-1R、N-RAS的表達(dá)水平，使其表達(dá)上調(diào)，證明miR-145是通過(guò)抑制靶基因IGF-1R、N-RAS的表達(dá)影響三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖。

圖5 雌、孕激素及miR-145對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞VEGF表達(dá)水平的影響

A:miR-SCR組; B:miR-145組; C:miR-145+E2組; D:miR-145+P4組; E:miR-145+E2+P4組;與miR-145組比較：*P<0.05，**P<0.01

腫瘤新的血管生成是指從已存在的微血管上生出新的毛細(xì)血管的過(guò)程，有別于胚胎時(shí)期由早期內(nèi)皮細(xì)胞分化形成新血管的血管發(fā)生。生理?xiàng)l件下的血管生成是一個(gè)嚴(yán)格受控的過(guò)程，只見(jiàn)于發(fā)育、再生和創(chuàng)傷修復(fù)等情況下。而病理性的血管生成則是一個(gè)持續(xù)、無(wú)控性的過(guò)程，可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲與轉(zhuǎn)移。如果沒(méi)有新的血管生成，?>1～2 mm的腫瘤就會(huì)由于缺乏所需的營(yíng)養(yǎng)而無(wú)法繼續(xù)生長(zhǎng)，因此腫瘤新的血管生成在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，而VEGF是最強(qiáng)的血管生成因子，在血管系統(tǒng)形成、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和通透性的調(diào)節(jié)及腫瘤新的血管生成中起關(guān)鍵作用[10]。有研究[11]探討激素促進(jìn)受體陰性乳腺癌生長(zhǎng)的機(jī)制，提出可能由VEGF動(dòng)員募集骨髓間充質(zhì)來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞至腫瘤組織，促進(jìn)腫瘤新的血管生成從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖。也有研究[12]表明，miRNAs在VEGF介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生和新的血管生成中起著重要的作用。作為miR-145靶基因IGF-1R和N-RAS，IGF-1R廣泛表達(dá)于多種類型的細(xì)胞表面，可促進(jìn)細(xì)胞的分裂增殖，導(dǎo)致細(xì)胞向惡性表型轉(zhuǎn)化[13]。近來(lái)有研究[14-15]提出，IGF-1R、N-RAS均與三陰性乳腺癌關(guān)系密切，可以作為一個(gè)很好的預(yù)后指標(biāo)，且均可調(diào)控下游信號(hào)分子VEGF的表達(dá)[12,15]。本研究qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-SCR組相比，miR-145組VEGF的表達(dá)顯著下降，再次驗(yàn)證了miR-145對(duì)三陰性乳腺癌的抑癌作用，并提示miR-145是通過(guò)抑制靶基因IGF-1R、N-RAS的表達(dá)水平，從而調(diào)控下游信號(hào)分子VEGF的活性表達(dá)，最終抑制腫瘤新血管的生成，影響腫瘤細(xì)胞的增殖能力；與miR-145組相比，miR-145+E2組、miR-145+ P4組、miR-145+ E2+ P4組VEGF的表達(dá)上調(diào)，提示雌激素和孕激素會(huì)通過(guò)miR-145調(diào)控三陰性乳腺癌新的血管生成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，并且雌、孕激素聯(lián)合作用促進(jìn)腫瘤新血管生成作用更強(qiáng)。由此可見(jiàn)，雌、孕激素聯(lián)合給藥是可調(diào)控miR-145靶基因IGF-1R、N-RAS及其下游信號(hào)分子VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞新的血管生成和細(xì)胞增殖，逆轉(zhuǎn)miR-145在三陰性乳腺癌中的抑癌作用。

通過(guò)培養(yǎng)三陰性乳腺癌MDA-MB-231/miR-145和MDA-MB-231/miR-SCR穩(wěn)定細(xì)胞株，本研究闡述了雌、孕激素在三陰性乳腺癌發(fā)生中的作用及相關(guān)分子機(jī)制，結(jié)果表明，雌、孕激素聯(lián)合給藥可以逆轉(zhuǎn)miR-145的抑癌作用，從而明顯促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖，這與增加miR-145靶基因IGF-1R、N-RAS及其下游信號(hào)分子VEGF的表達(dá)有關(guān)，為臨床三陰性乳腺癌防治提供新的靶點(diǎn)和方向。

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