補骨脂乙素對鼻咽癌細胞增殖和凋亡的影響及其機制

杜少鵬，王佳栩，蔡偉杰，許南松，藍文琪，陳捷蕓，李彬彬

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是原發(fā)于鼻咽黏膜上皮的惡性腫瘤，多見于東南亞國家和我國南方地區(qū)(廣東、廣西和湖南等)，是高發(fā)于我國的十大惡性腫瘤之一。以鉑類藥物為主的聯(lián)合用藥作為目前鼻咽癌放化綜合治療常用的一線方案，取得一定效果，但對機體有較大的毒副作用[1]。因此，從天然藥物中尋找低毒、高效的抗癌活性成分，對于改善鼻咽癌的臨床療效及預(yù)后仍具有重要意義。補骨脂乙素(isobavachalcone，IBC)是一種從中藥補骨脂中提取的天然査爾酮類小分子化合物，具有抗菌、抗氧化和抗腫瘤等多種藥理作用。近年來研究[2-4]顯示IBC對多種腫瘤細胞，如神經(jīng)母細胞瘤、卵巢癌、前列腺癌和胃癌等都有明顯的抑制作用，但對鼻咽癌細胞的作用及其機制尚不清楚。該研究旨在探討IBC對鼻咽癌CNE-2Z細胞增殖和凋亡的影響及其作用機制，以期為IBC抗腫瘤的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑補骨脂乙素(純度≥98%)購自天津士蘭科技有限公司；用二甲基亞砜溶解后配置成100 mmol/L的母液，-20 ℃保存，臨用時加培養(yǎng)基稀釋成所需濃度；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；EdU細胞增殖檢測試劑盒購自廣州銳博生物公司；AnnexinV-FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司；兔抗人磷酸化核糖體S6激酶2(phospho-ribosomal S6 kinase 2，p-RSK2)、核糖體S6激酶2(ribosomal S6 kinase 2，RSK2)和c-Jun多克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；鼠抗人B淋巴細胞瘤/白血病-2(B-cell leukemia/lymphoma 2，Bcl-2)單克隆抗體購自美國BD公司；鼠抗人Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；DyLight 680/DyLight 800標(biāo)記的紅外二抗購自美國Abbkine公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) CNE-2Z細胞為人低分化鼻咽癌上皮細胞株，由廣東醫(yī)科大學(xué)中美腫瘤研究所提供，采用含10% 胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基進行常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2CCK-8法檢測 將CNE-2Z細胞以100 μl細胞懸液含2 000個細胞接種于96孔板中，24 h后分別加入終濃度為0、5、10、20、40 μmol/L的IBC(每組設(shè)5個復(fù)孔)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h；棄去上清液，每孔加入含10 μl CCK-8溶液的培養(yǎng)基100 μl，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定吸光度(OD)值，計算IBC對CNE-2Z細胞的生長抑制率，抑制率(%)=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%。采用IC50軟件計算各時間點的IC50值。

1.2.3EdU細胞增殖實驗 將CNE-2Z細胞以100 μl細胞懸液含2 000個細胞接種于96 孔板中，24 h后分別給予終濃度為0、20、40 μmol/L的IBC(每組設(shè)3個復(fù)孔)，作用48 h；隨后加入終濃度為50 μmol/L 的EdU作用2 h；棄上清液，加入4% 多聚甲醛室溫固定 30 min，在0.5% Triton X-100中透膜20 min；隨后依次加入1×Apollo染色反應(yīng)液和1×Hoechst 33342反應(yīng)液，分別室溫避光孵育30 min；熒光顯微鏡下觀察、采集圖像，所有細胞核顯示藍色熒光(Hoechst染色)，處于增殖期的細胞核則顯示紅色熒光(EdU標(biāo)記)。隨機選取5個視野，計算EdU標(biāo)記陽性率，EdU標(biāo)記陽性率(%)=EdU陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.2.4平板克隆形成實驗 將CNE-2Z 細胞以每孔400 個細胞接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h后分別加入終濃度為0、5、10 μmol/L的IBC(每組設(shè)3個復(fù)孔)，連續(xù)培養(yǎng)約2周；采用甲醇固定細胞，0.4%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計數(shù)>50個細胞的克隆數(shù)。

1.2.5流式細胞儀檢測 將CNE-2Z 細胞以適當(dāng)密度接種于6孔板中， 24 h后分別給予終濃度為0、20、40 μmol/L IBC，作用48 h；離心收集細胞，加入500 μl binding buffer重懸細胞；隨后依次加入5 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI染液混勻，室溫避光孵育15 min；在1 h內(nèi)采用流式細胞儀檢測分析細胞凋亡情況。

1.2.6Western blot檢測 取對數(shù)生長期CNE-2細胞，給予終濃度為0、20、40 μmol/L的IBC作用48 h，加入RIPA裂解液，冰上裂解20 min, 離心收集上清液(總蛋白)；用BCA法測定蛋白濃度后，取等量蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，濕轉(zhuǎn)印至NC膜上；將膜用封閉液(含5%脫脂奶粉)室溫封閉2 h后，加入相應(yīng)的一抗(用一抗稀釋液配制)，于4 ℃孵育過夜；次日用TBST清洗后加入相應(yīng)的紅外標(biāo)記的二抗(用TBST稀釋)，室溫孵育2 h；采用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)進行掃描，Quantity one軟件對蛋白條帶進行半定量分析，以β-actin 作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1IBC對CNE-2Z細胞活性的影響給予不同濃度的IBC作用CNE-2Z 細胞24、48 h后，采用CCK-8法檢測細胞活性的改變。與對照組相比，IBC可明顯抑制CNE-2Z細胞活力，且隨著藥物作用時間的延長和藥物濃度的增加，細胞存活率逐漸降低，抑制率逐漸增加，呈明顯的時間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)關(guān)系，各實驗組間抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(24 h：F=28.66，P<0.05；48 h：F=152.10，P<0.05)，其24 h和48 h的IC50值分別為74.08和25.70 μmol/L。見圖1。

圖1 IBC對CNE-2Z 細胞活性的影響

2.2IBC對CNE-2Z細胞增殖能力的影響為了進一步證實IBC對CNE-2Z細胞增殖活性的抑制作用，采用EdU法檢測細胞增殖能力的改變。隨著IBC藥物濃度的增加，EdU 陽性細胞的百分比逐漸減少，呈劑量依賴性，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=66.25，P<0.05)，提示 IBC 可有效抑制CNE-2Z細胞的增殖，使處于增殖期的細胞比率減少。見圖2。

2.3IBC對CNE-2Z細胞克隆形成能力的影響采用平板克隆形成實驗檢測CNE-2Z細胞克隆形成能力的改變。IBC可有效抑制CNE-2Z細胞的克隆形成能力，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=52.01，P<0.05)；與對照組細胞相比，10 μmol/L IBC可顯著抑制細胞的克隆形成能力，其形成克隆變小且數(shù)目明顯減少(P<0.001)。見圖3。

2.4IBC對CNE-2Z細胞凋亡的誘導(dǎo)作用采用AnnexinV-FITC/ PI雙染法檢測CNE-2Z細胞凋亡率的改變。對照組細胞的凋亡率(包括早期和晚期凋亡率)為(4.70 ± 0.69)%，給予20和40 μmol/L IBC處理后，細胞的凋亡率明顯增高，分別為(17.97 ± 3.10)%和(29.03 ± 1.65)%，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=104.30，P<0.05)；隨著IBC濃度的增加，細胞早期凋亡率亦逐漸增高，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系(F=37.49，P<0.05)。見圖4。

圖2 IBC對 CNE-2Z 細胞增殖的抑制作用 ×200

A：對照組；B：20 μmol/L IBC處理組；C：40 μmol/L IBC處理組；
1：Hoechst染色(藍色)；2：EdU染色(紅色)；3：Hoechst染色和EdU染色的融合；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.001

2.5IBC對CNE-2Z細胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白的影響采用Western blot檢測CNE-2Z 細胞中相關(guān)蛋白表達的改變。與對照組相比，給予20、40 μmol/L IBC處理后細胞中p-RSK2和c-Jun的表達水平均明顯下降，而總RSK2的表達沒有改變；IBC亦可引起B(yǎng)cl-2表達的降低，而Bax的表達則升高，與對照組相比，20、40 μmol/L IBC處理后Bcl-2/Bax的比值分別下調(diào)47.24%和69.50%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖3 IBC對 CNE-2Z 細胞克隆形成的影響

A：對照組；B：5 μmol/L IBC處理組；C：10 μmol/L IBC處理組；與對照組比較：**P<0.001

3 討論

中藥補骨脂為豆科草本植物補骨脂的成熟干燥種子，具有溫腎、助陽等功效，在中藥方劑中作為君藥有擴冠強心、止血、增強免疫功能、抗菌和抗腫瘤等作用。IBC是從補骨脂中提取的一種活性成分，屬于天然查爾酮類小分子化合物。近年來研究[2-4]顯示，IBC對多種腫瘤細胞均有抑制作用。IBC可通過線粒體途徑誘導(dǎo)神經(jīng)母細胞瘤凋亡，但對正常小腦顆粒細胞沒有明顯影響[2]。Jing et al[3]顯示IBC可抑制卵巢癌、前列腺癌和肺癌等多種腫瘤細胞的增殖，并誘導(dǎo)細胞凋亡，但對正常肝細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞無明顯毒性作用，其機制與下調(diào)蛋白激酶B磷酸化和活性水平，進而促發(fā)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶依賴的凋亡通路有關(guān)。IBC亦可抑制化學(xué)致癌物誘導(dǎo)的小鼠皮膚癌的發(fā)生[5]。這些結(jié)果提示，IBC作為一種來源經(jīng)濟的天然小分子藥物，具有活性高、毒副作用小等特點，其臨床應(yīng)用價值值得關(guān)注。

圖4 IBC對 CNE-2Z 細胞凋亡的誘導(dǎo)作用

A：對照組；B：20 μmol/L IBC處理組；C：40 μmol/L IBC處理組；Q1： 壞死細胞區(qū)；Q2：晚期凋亡細胞區(qū)；Q3：活細胞區(qū)；Q4：早期凋亡細胞區(qū)；與對照組比較：**P<0.01

圖5 IBC對 CNE-2Z 細胞蛋白表達的影響

A：Western blot檢測各組蛋白表達水平；B：各組Bcl-2/Bax的比值；1：對照組；2：20 μmol/L IBC處理組；3：40 μmol/L IBC處理組；與對照組相比：*P<0.05，**P<0.005

本研究應(yīng)用不同濃度的IBC處理低分化鼻咽癌細胞CNE-2Z后顯示，IBC可明顯抑制CNE-2Z細胞的增殖和克隆形成，具有時間、濃度依賴性。進一步采用AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，結(jié)果顯示與未處理組細胞相比，IBC可顯著誘導(dǎo)CNE-2Z細胞凋亡，細胞早期凋亡率明顯增高，提示IBC抑制鼻咽癌細胞增殖的作用可能與其誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)。

RSK2是p90RSK家族的成員之一，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶。RSK2是ERK1/2下游的直接底物，在生長因子等刺激作用下，發(fā)生多個位點的磷酸化而被激活。近年來，在多種腫瘤組織中如頭頸部鱗狀細胞癌、皮膚癌和前列腺癌等都顯示有RSK2表達或活性的增高，且與患者的不良預(yù)后相關(guān)[6]。抑制RSK2活性或下調(diào)其表達均可有效抑制多種腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)化和侵襲，亦可增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[6-7]。這些結(jié)果提示，RSK2可能是一個潛在的抗癌靶標(biāo)。

RSK2在腫瘤發(fā)生中的作用歸因于其廣泛的底物分子，活化的RSK2可轉(zhuǎn)入核中磷酸化多種底物蛋白，包括cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白、糖原合成激酶3、促凋亡蛋白Bad和熱休克蛋白27等，進而調(diào)控增殖、分化和凋亡相關(guān)蛋白的表達。RSK2也要介導(dǎo)組蛋白H3表觀修飾的改變，在表皮生長因子和佛波酯等腫瘤促進因子的作用下，RSK2可促進組蛋白H3Ser10磷酸化，進而調(diào)控即刻早期基因c-Jun和c-Fos等的轉(zhuǎn)錄激活。c-Jun是核轉(zhuǎn)錄激活蛋白1家族的重要成員，其異?；罨c多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。c-Jun可正向調(diào)控細胞周期，促進腫瘤細胞的增殖。在乳腺癌細胞中，阻斷c-Jun活性可抑制cyclinD1等細胞周期相關(guān)蛋白的表達，導(dǎo)致細胞周期阻滯[8]。c-Jun亦具有抗凋亡作用，過表達c-Jun可有效抑制長春新堿誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡[9]。Eferl et al[10]研究發(fā)現(xiàn)，c-Jun抗凋亡作用可能與其抑制p53活性進而調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bcl-XL有關(guān)。本研究顯示，IBC可呈劑量依賴性地抑制p-RSK2和c-Jun的表達水平，但對總RSK2的表達沒有影響，提示IBC可能通過抑制RSK2活性及c-Jun表達來發(fā)揮抗鼻咽癌細胞的生物學(xué)作用。

Bcl-2和Bax是線粒體凋亡通路中重要的抗凋亡基因和促凋亡基因，兩者的比值決定了對細胞凋亡抑制作用的強弱。Chen et al[11]研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2在低分化鼻咽癌組織中的表達要明顯高于正常鼻咽黏膜組織和鼻咽慢性炎癥組織，并且與鼻咽癌放射敏感性及預(yù)后密切相關(guān)。采用小干擾RNA或小分子抑制劑下調(diào)Bcl-2的表達可以增強鼻咽癌細胞對放化療的敏感性[12]。本研究檢測不同濃度IBC對鼻咽癌CNE-2Z細胞Bcl-2和Bax表達的影響，結(jié)果顯示，隨著IBC作用濃度的增加，Bcl-2的表達逐漸降低，而Bax的表達增高，Bcl-2/Bax蛋白之間的比值明顯下降，提示IBC可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)細胞凋亡。IBC導(dǎo)致Bcl-2表達的下調(diào)有望改善鼻咽癌細胞的放射敏感性和耐藥性，但仍有待進一步研究證實。RSK2亦要參與Bcl-2/Bax表達的調(diào)控。RSK2可磷酸化促凋亡蛋白Bad，使之不能與Bcl-XL結(jié)合，從而恢復(fù)Bcl-2的抗凋亡能力[13]；RSK2還可通過誘導(dǎo)死亡相關(guān)蛋白激酶的磷酸化進而調(diào)控Bcl-2/Bax的比值[14]。

綜上所述，IBC作為一種從天然藥物中提取的低毒小分子化合物，可明顯抑制鼻咽癌CNE-2Z細胞增殖，并誘導(dǎo)細胞凋亡。RSK2可能是IBC作用的重要靶分子，其對轉(zhuǎn)錄因子c-Jun和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax的調(diào)控可能是IBC抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡的重要機制。

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