基于上轉(zhuǎn)換熒光標(biāo)記的氯噻啉免疫層析方法研究

華修德 尤紅杰 楊家川 施海燕 王鳴華

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院， 南京 210095)

1 引 言

氯噻啉(Imidaclothiz)是一種高效、 低毒、 廣譜的新型煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑，主要作用于昆蟲(chóng)的煙酸乙酰膽堿酯酶受體，用于防治水稻、 小麥、 蔬菜、 煙草、 茶樹(shù)、 棉花的刺吸式害蟲(chóng)，如小綠葉蟬、 白粉虱、 稻飛虱、 蚜蟲(chóng)等[1]，此外也可用于防治鱗翅目、 鞘翅目和雙翅目害蟲(chóng)，尤其是對(duì)水稻螟蟲(chóng)具有很高的防效[2]。然而，大量研究證明，新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑對(duì)蜜蜂等傳粉昆蟲(chóng)具有高毒性[3～5]，我國(guó)國(guó)標(biāo)規(guī)定了氯噻啉在農(nóng)產(chǎn)品中的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，其在糙米、 小麥、 柑橘和茶葉的最大殘留限量分別為0.1、 0.2、 0.2和3.0 mg/kg[6]。因此，建立經(jīng)濟(jì)、 快速、 簡(jiǎn)便的氯噻啉檢測(cè)方法對(duì)保障環(huán)境和食品安全具有重要的意義。

目前，氯噻啉的主要檢測(cè)方法為儀器分析法，如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7]、 液相色譜法[8,9]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10～12]。雖然儀器分析方法具有準(zhǔn)確度高、 穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，但是其檢測(cè)成本較高，檢測(cè)設(shè)備昂貴，需要專(zhuān)業(yè)的操作人員，樣品前處理較復(fù)雜， 且需要耗費(fèi)大量的有機(jī)溶劑。免疫檢測(cè)具有快速、 簡(jiǎn)便、 經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，已在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中得到了廣泛的研究。已報(bào)道的氯噻啉快速檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫分析(ELISA)[13]、 熒光偏振免疫分析(FPIA)[14]、 膠體金增強(qiáng)免疫層析(GICA)[15]、 量子點(diǎn)熒光免疫分析(QDFIA)、 時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)[16]等。雖然這些免疫檢測(cè)方法可以實(shí)現(xiàn)氯噻啉的定性或定量檢測(cè)，但是依然存在檢測(cè)步驟較多和(或)檢測(cè)信號(hào)易受樣品基質(zhì)干擾等不足。因此，有必要開(kāi)發(fā)操作簡(jiǎn)單、 受樣品基質(zhì)干擾小的檢測(cè)方法，提高免疫檢測(cè)的實(shí)用性。

標(biāo)記物或示蹤物是免疫檢測(cè)的重要的組成部分，其提供的檢測(cè)信號(hào)常影響檢測(cè)方法的特性。 Auzel 于1966年在研究NaYb(WO4)2鈉玻璃時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)基質(zhì)中含有Yb3+時(shí)，Er3+、 Tm3+等在近紅外光激發(fā)下，可以發(fā)射出可見(jiàn)光，由此提出了上轉(zhuǎn)換發(fā)光的概念[18]，即其激發(fā)光(長(zhǎng)波長(zhǎng))的能量比發(fā)射光(短波長(zhǎng))的能量低，所以稱(chēng)之為上轉(zhuǎn)換發(fā)光[18]。目前，常用的上轉(zhuǎn)換熒光納米材料(Upconversion nanoparticles，UCNPs)主要包括Gd2O3∶Yb, Er、 NaGdF4∶ Yb,Er、 NaYF4∶Yb,Tm、 Y2O3∶Yb,Er等。UCNPs是一種新型熒光材料，具有化學(xué)穩(wěn)定性好、 發(fā)光強(qiáng)度高、 毒性小、 Stokes位移大、 發(fā)射光譜窄、 不易發(fā)生光漂白等優(yōu)點(diǎn)，并且由于使用了難以被樣品基質(zhì)所吸收的近紅外光為激發(fā)光源，消除了背景熒光的干擾，提高了信噪比和檢測(cè)靈敏度。目前，UCNPs作為標(biāo)記物已被用于氟喹諾酮類(lèi)藥物[19]、 磺胺喹噁啉[20]、 黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A[21]等的定量檢測(cè)。本研究組前期工作中，以UCNPs為標(biāo)記物建立基于內(nèi)濾效應(yīng)(Inner filter effect，IFE)的競(jìng)爭(zhēng)免疫分析方法，并用于檢測(cè)環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中的氯噻啉，結(jié)果表明，UCNPs作為示蹤物可有效的降低田水、 土壤、 梨、 大米、 蘋(píng)果、 番茄、 青菜和甘藍(lán)等樣品基質(zhì)的干擾[22]。

本研究采用氯噻啉單克隆抗體標(biāo)記的NaYF4∶Yb,Er UCNPs作為熒光標(biāo)記物，制備了上轉(zhuǎn)換熒光免疫層析(Upconversion immunochromatographic assay，UICA)試紙條，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件(UCNPs標(biāo)記物的濃度、 檢測(cè)線(Test line，T-L)上的包被原濃度、 控制線(Control line，C-L)上的羊抗鼠IgG濃度、 檢測(cè)溶液的pH值、 離子強(qiáng)度、 甲醇含量、 檢測(cè)時(shí)間等)，建立了UICA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在田水、 土壤、 桃、 梨、 黃瓜、 番茄、 小麥、 大米等基質(zhì)中進(jìn)行了添加回收實(shí)驗(yàn)，并使用高效液相色譜法對(duì)UICA的實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

XYZ-3000三維噴條儀、 CM4000 切條儀(美國(guó)BioDot公司); F-2700熒光分光光度計(jì)(日本日立公司); 980 nm 激光器(長(zhǎng)春鐳射光電科技有限公司); 各種規(guī)格的單通道移液器(德國(guó)Eppendorf公司); Agilent 1260 HPLC儀(美國(guó)Agilent公司); H-7650透射電鏡(TEM, 日本日立公司); Zetasizer Nano 納米粒度電位儀(英國(guó)Malvern公司); 5418R臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司); MUL9000(A)-30純水系統(tǒng)(南京總馨純水設(shè)備有限公司); FW135粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司); JS31-300多功能攪拌機(jī)(浙江紹興蘇泊爾生活電器有限公司)。

氯噻啉(97.0%，南通江山農(nóng)藥股份有限公司); 其它煙堿類(lèi)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(江蘇農(nóng)藥研究所有限公司); 羊抗鼠IgG(美國(guó)Sigma公司); 牛血清蛋白(BSA，98.0%，北京索萊寶科學(xué)與技術(shù)有限公司); 硝酸纖維素(Nitrocellulose，NC)膜(Millipore135)、 玻璃纖維墊、 樣品墊和吸水墊(美國(guó)Millipore公司); 氯噻啉單克隆抗體(1E7)和包被抗原由實(shí)驗(yàn)室自制[13]; 氨基功能化的NaYF4∶Yb,Er UCNPs由實(shí)驗(yàn)室自制[22]; 其它試劑均為分析純。

2.2 氯噻啉單克隆抗體與UCNPs的偶聯(lián)

采用經(jīng)典的戊二醛交聯(lián)法將氯噻啉抗體與氨基功能化的NaYF4∶Yb,Er UCNPs偶聯(lián)[23,24]。稱(chēng)取10 mg氨基功能化的UCNPs于2.5 mL 0.01 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH 8.0)中，超聲分散15 min。加入0.64 mL 25% 戊二醛溶液和50 mg NaBH4，室溫下緩慢振蕩1 h。反應(yīng)結(jié)束后，用上述硼酸鹽緩沖溶液洗滌3次，離心，除去上清液。加入3 mL硼酸鹽緩沖液重新分散沉淀，加入0.6 mL 1 mg/mL氯噻啉抗體和50 mg NaBH4，室溫下緩慢振蕩1 h，加入50 mg Tris作為封閉劑，繼續(xù)緩慢振蕩1 h。反應(yīng)結(jié)束后離心分離，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，移去上層溶液，用5 mL硼酸鹽緩沖液分散沉淀，即得到標(biāo)記氯噻啉單克隆抗體的UCNPs標(biāo)記物。

2.3 UICA試紙條的組裝及檢測(cè)

UICA試紙條上所用試劑均使用XYZ-3000三維噴條儀進(jìn)行噴涂。氯噻啉單克隆抗體標(biāo)記的UCNPs均勻地噴涂在結(jié)合墊上，37℃干燥3 h。氯噻啉人工抗原和羊抗鼠IgG分別噴涂在NC膜的左側(cè)和右側(cè)，相距5 mm，作為T(mén)-L和C-L，37℃干燥2 h。將NC膜粘貼于聚氯乙烯粘性底板中間的位置; 結(jié)合墊粘貼于NC膜的左側(cè)，與NC膜重疊1 mm; 吸水墊粘貼于NC膜的右側(cè)，與NC膜重疊1 mm; 樣品墊粘貼于結(jié)合墊的左側(cè)，與其重疊2 mm。組裝好后整個(gè)底板用切條儀切成4.08 mm寬的試紙條，干燥條件下常溫保存待用(圖1)。

將待測(cè)樣品溶液加到試紙條的樣品墊，樣品液會(huì)因毛細(xì)作用沿試紙條向右側(cè)移動(dòng)。當(dāng)樣品溶液移動(dòng)到結(jié)合墊時(shí)，結(jié)合墊上的UCNPs標(biāo)記物會(huì)分散在樣品液中，并隨樣品液繼續(xù)向前移動(dòng)。到達(dá)T-L后，樣品溶液中的氯噻啉將與T-L上的包被抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合UCNPs標(biāo)記物上的抗體，氯噻啉的濃度越高，T-L的熒光強(qiáng)度越弱。未被T-L結(jié)合的UCNPs標(biāo)記物繼續(xù)移動(dòng)到C-L后與C-L上的羊抗鼠IgG結(jié)合，使C-L產(chǎn)生熒光，表明檢測(cè)結(jié)果有效; 若C-L未產(chǎn)生熒光，表明檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。加樣25 min后，使用外接980 nm激光光源的熒光分光光度計(jì)對(duì)試紙條T-L在544 nm處的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定。以UICA試紙條T-L熒光強(qiáng)度變化值(ΔI=I-I0， 其中，I為有分析物時(shí)T-L在544 nm的熒光強(qiáng)度;I0為無(wú)分析物時(shí)T-L在544 nm的熒光強(qiáng)度，即陰性對(duì)照的熒光強(qiáng)度。)為縱坐標(biāo)，氯噻啉濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制校正曲線，獲得線性方程，計(jì)算出抑制中濃度(Half-maximal inhibition concentration，IC50)、 檢出限(IC10)和線性范圍(IC10～I(xiàn)C90)。

圖1 上轉(zhuǎn)換熒光免疫層析(UICA)試紙條示意圖Fig.1 Schematic diagram of upconversion immunochromatographic assay (UICA) strip

2.4 條件優(yōu)化

2.4.1試紙條參數(shù)優(yōu)化用生理鹽水配制系列稀釋倍數(shù)的氯噻啉包被抗原，將其噴涂在NC膜上作為T(mén)-L，分別建立不同T-L稀釋倍數(shù)下的標(biāo)準(zhǔn)曲線，選擇I0與IC50比值(I0/IC50)最大的稀釋倍數(shù)作為最佳稀釋倍數(shù)。在確定T-L上氯噻啉包被抗原的用量后，優(yōu)化UCNPs標(biāo)記物的用量。選擇檢測(cè)陰性樣品時(shí)，T-L熒光強(qiáng)度不再明顯增強(qiáng)時(shí)對(duì)應(yīng)的UCNPs標(biāo)記物用量為其最佳用量。設(shè)置系列C-L上羊抗鼠IgG的噴涂濃度，選擇檢測(cè)陰性樣品時(shí)，C-L和T-L熒光強(qiáng)度相近的濃度作為其最佳濃度。

2.4.2工作條件的優(yōu)化對(duì)檢測(cè)緩沖液的pH值(5.0、 6.0、 7.4、 8.0、 9.0和10.0)、 NaCl濃度(0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5和0.6 mol/L)、 甲醇含量(0、 2.5%、 5%和10%)、 PEG20000含量(0、 0.05%、 0.1%、 0.2%、 0.4%和0.8%)及檢測(cè)時(shí)間(5、 10 、 15、 20、 25、 30和35 min)進(jìn)行優(yōu)化。在上述的檢測(cè)緩沖液下建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，選擇I0/IC50最大值對(duì)應(yīng)的條件為最優(yōu)條件。檢測(cè)時(shí)間選擇檢測(cè)陰性樣品時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值所需的最短時(shí)間。

2.5 特異性評(píng)價(jià)

在最優(yōu)條件下，使用UICA對(duì)氯噻啉結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，建立各類(lèi)似物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算IC50，根據(jù)公式(交叉反應(yīng)率(Cross-reactivity，CR)= IC50(氯噻啉)/IC50(氯噻啉結(jié)構(gòu)類(lèi)似物)×100)計(jì)算CR，并評(píng)價(jià)UICA的特異性。

2.6 添加回收實(shí)驗(yàn)

量取10 mL過(guò)濾后的田水空白樣品，添加氯噻啉標(biāo)準(zhǔn)溶液使其濃度分別為80、 200和500 ng/mL; 稱(chēng)取10 g粉碎后的土壤、 桃、 梨、 黃瓜、 番茄、 小麥、 大米空白樣品(其中土壤碾碎處理; 桃、 梨、 黃瓜、 番茄用榨汁機(jī)勻漿處理; 小麥、 大米用粉碎機(jī)粉碎處理)于三角瓶中，使氯噻啉添加濃度為200～5000 ng/g， 所有樣品混勻后靜置過(guò)夜。田水樣品稀釋后直接檢測(cè)。固體樣品：加入50 mL乙腈和5 mL水， 振蕩提取1 h，抽濾至加有5 g NaCl的具塞量筒中，劇烈振蕩30 s，靜置30 min，上層有機(jī)相過(guò)無(wú)水Na2SO4于平底燒瓶中，用乙腈對(duì)無(wú)水Na2SO4硫酸鈉淋洗一次，合并有機(jī)相，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用最優(yōu)緩沖溶液定容至10 mL，適當(dāng)稀釋后進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)添加濃度重復(fù)3次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2.7 方法驗(yàn)證

采集噴灑過(guò)10%氯噻啉可濕性粉劑的田水和梨樣品，分別使用UICA和HPLC進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。UICA的樣品前處理和檢測(cè)參照添加回收實(shí)驗(yàn)。

HPLC法[22]：梨樣品(20 g)用50 mL乙腈和5 mL水振蕩提取1 h，抽濾后加入5 g NaCl進(jìn)行分層，有機(jī)相過(guò)無(wú)水Na2SO4后真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干; 田水樣品加5 g NaCl后用30 mL乙腈萃取2次，合并有機(jī)相后過(guò)無(wú)水Na2SO4，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。使用2 mL甲醇-水(30∶70，V/V)定容后進(jìn)行檢測(cè)。儀器條件：色譜柱為Eclipse pluse-C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(30∶70，V/V)，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，流速0.9 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。

3 結(jié)果與討論

3.1 氯噻啉單克隆抗體與UCNPs偶聯(lián)物的鑒定

用納米粒度電位儀和TEM儀對(duì)氨基功能化UCNPs和氯噻啉抗體與UCNPs偶聯(lián)物的粒徑和形態(tài)進(jìn)行鑒定。UCNPs在標(biāo)記前和標(biāo)記后的平均粒徑分別為82.5和86.7 nm，標(biāo)記后的平均粒徑略大。標(biāo)記后的UCNPs在形態(tài)上發(fā)生了明顯的變化，氨基功能化的UCNPs表面光滑，而抗體標(biāo)記后的UCNPs表面粗糙(圖2)。通過(guò)TEM的結(jié)果可以初步確定UCNPs的表面已標(biāo)記上氯噻啉單克隆抗體。

圖2 氨基功能化上轉(zhuǎn)換熒光納米材料(UCNPs)(A)和抗體與UCNPs偶聯(lián)物(B)的透射電鏡圖(TEM)Fig.2 Transmission electron microscope (TEM) images of amino-modified upconversion nanoparticles (UCNPs) (A) and the conjugation of antibody and UCNPs (B)

3.2 條件優(yōu)化

3.2.1試紙條參數(shù)當(dāng)包被抗原的濃度稀釋至40倍時(shí)，I0/IC50達(dá)到最大值，其對(duì)應(yīng)的包被抗原濃度為0.195 mg/mL，噴涂量為1 μL/cm(圖3A)。如圖3B所示，隨著UCNPs濃度的逐漸增加，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)T-L上人工抗原結(jié)合的UCNPs標(biāo)記物達(dá)到飽和后，T-L的熒光強(qiáng)度不再繼續(xù)增加，此時(shí)對(duì)應(yīng)的UCNPs標(biāo)記物濃度為3 mg/mL，噴涂量為3 μL/cm。當(dāng)羊抗鼠IgG濃度為0.15 mg/mL，噴涂量為1 μL/cm時(shí)， C-L的熒光強(qiáng)度與T-L接近。

圖3 (A)包被抗原濃度對(duì)上轉(zhuǎn)換熒光免疫層析敏感性的影響; (B)上轉(zhuǎn)換熒光納米材料(UCNPs)標(biāo)記物濃度對(duì)檢測(cè)線(T-L)熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 (A) Effect of coating antigen concentration on the sensitivity of UICA; (B) effect of concentration of conjugated UCNPs on fluorescence intensity of test line (T-L)

3.2.2試紙條工作條件在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的系列pH值、 離子強(qiáng)度和PEG20000含量的條件下，I0/IC50值都先升高再降低(圖4A～4C)，最優(yōu)條件為pH=8.0、 0.3 mol/L NaCl、 0.2% PEG20000。在測(cè)試的系列甲醇含量的緩沖溶液中，I0/IC50值隨著甲醇含量的升高而降低，在不含甲醇時(shí)，I0/IC50值達(dá)到最大(圖4D)。但是，甲醇作為助溶劑，在標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和樣品前處理中均被使用，為減少甲醇對(duì)檢測(cè)敏感性的降低，選擇添加2.5%甲醇。在檢測(cè)溶液加到樣品墊后的5～25 min內(nèi)，T-L的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)； 25 min后，T-L的熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，最佳檢測(cè)時(shí)間為25 min(圖4E)。

圖4 上轉(zhuǎn)換熒光免疫層析工作條件的優(yōu)化：(A)pH值; (B)鈉離子濃度; (C)PEG20000濃度; (D)甲醇濃度; (E)檢測(cè)時(shí)間Fig.4 Optimization of working conditions for UICA: (A) pH values; (B) concentration of Na+; (C) concentration of PEG20000; (D) concentration of methanol; (E) detection time

3.3 靈敏度

在最優(yōu)條件下，UICA對(duì)氯噻啉標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果如圖5A所示，氯噻啉濃度從1 ng/mL增大到4000 ng/mL時(shí)，其熒光光譜的強(qiáng)度逐漸降低。對(duì)544 nm處的熒光強(qiáng)度進(jìn)行線性擬合后獲得校正曲線和線性方程(圖5B)，計(jì)算的IC50為97.21 ng/mL，線性范圍(IC10～I(xiàn)C90)為26.30～363.08 ng/mL，最低檢出限(IC10)為26.30 ng/mL。將UICA與已發(fā)表的免疫檢測(cè)方法進(jìn)行比較(表1)，UICA的敏感性低于QDFIA、 TRFIA和IFE，與ELISA和FPIA相似。但UICA的IC50和最低檢出限均低于國(guó)家規(guī)定的最低限量標(biāo)準(zhǔn)(0.1 mg/kg)[23]，可以滿足氯噻啉殘留檢測(cè)的要求。此外，UICA的檢測(cè)步驟比ELISA、 QDFIA和TRFIA簡(jiǎn)便; 檢測(cè)時(shí)間比ELISA、 QDFIA、 TRFIA和IFE短; 示蹤物比ELISA、 FPIA、 GICA、 QDFIA和TRFIA抗樣品基質(zhì)干擾能力強(qiáng)。

3.4 特異性

UICA對(duì)氯噻啉類(lèi)似物標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)結(jié)果如表2所示。UICA除對(duì)吡蟲(chóng)啉有較高的CR(95.72%)外，對(duì)其它結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的CR可忽略不計(jì)。該結(jié)果與其它基于相同氯噻啉單克隆抗體建立的免疫分析方法[13～16,22]的結(jié)果一致，其原因是免疫分析方法的特異性主要由抗體的特性決定。由于氯噻啉和吡蟲(chóng)啉結(jié)構(gòu)相似，以氯噻啉或者吡蟲(chóng)啉半抗原制備的抗體常對(duì)兩種農(nóng)藥均可識(shí)別，建立的檢測(cè)方法也存在交叉反應(yīng)。

圖5 (A)檢測(cè)線(T-L)在系列濃度的氯噻啉標(biāo)準(zhǔn)品溶液下的熒光強(qiáng)度; (B)氯噻啉UICA校正曲線Fig.5 (A) Fluorescence intensity of test line (T-L) with serial concentrations of imidaclothiz standard solutions; (B) calibration curve of imidaclothiz by UICA

表1 氯噻啉免疫分析方法的比較

Table 1 Comparison of immunoassay methods for imidaclothiz

方法Method示蹤物TracerIC50或SC50a?IC50orSC50(ng/mL)檢測(cè)時(shí)間Detectiontime(min)檢測(cè)步驟Detectionstep參考文獻(xiàn)ReferenceELISA辣根過(guò)氧化物酶Horseradishperoxidase87．50>1656[13]FPIA異硫氰酸熒光素Fluoresceinisothiocyanate87．94111[14]GICA膠體金Colloidalgold25．00??101[15]QDFIA量子點(diǎn)Quantumdots20．412103[16]TRFIA銪離子Europiumion6．912154[16]IFE上轉(zhuǎn)換熒光納米材料UCNPs18．90501[22]UICA上轉(zhuǎn)換熒光納米材料UCNPs97．21251本研究Thisstudy?：飽和中濃度；??：定性檢測(cè)，未計(jì)算IC50，檢出限為25ng/mL。?：Theconcentrationofanalyteproducinga50%saturationofthesignal(SC50)；??：Qualitativetest，didnotcalculateIC50，thedetectionlimitwas25ng/mL．ELISA，Enzyme?linkedimmunosorbentassay；FPIA，F(xiàn)luorescencepolarizationimmunoassay；GICA，Goldimmunochroma?tographicassay；QDFIA，Quantumdots?basedfluoroimmunoassay；TRFIA，Time?resolvedfluoroimmunoassay；IFE，innerfiltereffect

3.5 準(zhǔn)確度

在樣品檢測(cè)前需去除樣品基質(zhì)的影響，使用緩沖液對(duì)樣品基質(zhì)進(jìn)行稀釋是免疫檢測(cè)最常用、 最簡(jiǎn)便的降低基質(zhì)干擾的方法。使用緩沖液對(duì)8種樣品的空白基質(zhì)進(jìn)行系列稀釋后建立各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并與緩沖液標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)比，選擇與緩沖液標(biāo)準(zhǔn)曲線相似的最低稀釋倍數(shù)。結(jié)果表明， 田水樣品稀釋2倍; 土壤、 梨、 桃和小麥樣品提取液稀釋5倍，黃瓜和番茄樣品提取液稀釋10倍，大米樣品提取液稀釋20倍后的標(biāo)準(zhǔn)曲線與緩沖液標(biāo)準(zhǔn)曲線相似，即基質(zhì)影響已被去除或可忽略不計(jì)。

在相應(yīng)的稀釋倍數(shù)下，UICA對(duì)田水、 土壤、 梨、 桃、 小麥、 黃瓜、 番茄、 大米添加樣品的檢測(cè)結(jié)果如表3所示。平均添加回收率為71.8%～97.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%～10.7%。表明本方法準(zhǔn)確度較好，能夠滿足環(huán)境樣品和農(nóng)產(chǎn)品中氯噻啉殘留的定量檢測(cè)的要求。

3.6 實(shí)際樣品分析

UICA對(duì)田水和梨實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果表明， 田水樣品中氯噻啉的含量在70.5～685.9 ng/mL之間，梨樣品中氯噻啉的含量在176～1468.5 ng/g之間。UICA的檢測(cè)結(jié)果與HPLC的結(jié)果(田水： 84.2～655.2 ng/mL; 梨： 124.1～1463.1 ng/g)接近。兩種方法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性如圖6所示，相關(guān)性方程為y=1.0575x-22.7513，R2=0.9797，其斜率≈1，說(shuō)明具有較高的相關(guān)性。結(jié)果表明，UICA的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、 可靠，可用于實(shí)際樣品中氯噻啉殘留的定量檢測(cè)。

表2 上轉(zhuǎn)換熒光免疫層析對(duì)氯噻啉結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的交叉反應(yīng)

Table 2 Cross-reactivity of analogues structurally related to imidaclothiz toward its analogues determined by UICA

化合物Compound化學(xué)結(jié)構(gòu)式Chemicalstructure抑制中濃度IC50(ng/mL)交叉反應(yīng)率CR(%)氯噻啉Imidaclothiz97．37100吡蟲(chóng)啉Imidacloprid101．7295．7噻蟲(chóng)嗪ThiamethoxamNNN—NO2SClOH3C—N>100000<0．1烯啶蟲(chóng)胺Nitenpyram>100000<0．1噻蟲(chóng)啉Thiacloprid6555．071．5啶蟲(chóng)脒Acetamiprid2226．214．4呋蟲(chóng)胺Dinotefuran>100000<0．1

表3 上轉(zhuǎn)換熒光免疫層析對(duì)氯噻啉添加樣品的平均回收率

Table 3 Average recoveries of samples spiked with imidaclothiz by UICA (n=3)

樣品Sample添加濃度Spiked(ng/gorng/mL)實(shí)測(cè)濃度Measured(ng/gorng/mL)平均回收率Recovery(%)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Relativestandarddeviation(RSD，%)田水Paddywater土壤Soil梨Pear桃Peach小麥Wheat黃瓜Cucumber8065．8±3．482．25．2200176．4±11．588．26．5500421．6±24．184．35．7200154．7±4．877．43．1500455．7±4．781．01．01000809．5±20．695．32．6200157．4±9．878．76．2500362．4±5．772．51．61000823．7±48．582．45．9200170．6±12．085．37．0500413．2±9．482．62．31000972．5±12．097．21．2200169．5±5．484．73．2500406．4±12．681．33．11000932．2±6．793．20．7200143．5±7．871．85．4500426．2±8．185．21．21000817．3±12．181．71．5

續(xù)表3(Continued to Table 3)

樣品Sample添加濃度Spiked(ng/gorng/mL)實(shí)測(cè)濃度Measured(ng/gorng/mL)平均回收率Recovery(%)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Relativestandarddeviation(RSD，%)番茄Tomato大米R(shí)ice500373．2±16．974．64．51000806．6±16．880．72．120001661．7±76．183．14．6800648．3±20．981．03．220001612．8±32．980．62．050003688．1±395．673．810．7

圖6 UICA與HPLC對(duì)氯噻啉實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation between results by UICA and HPLC for authentic samples of imidaclothiz

4 結(jié) 論

本研究建立了一種基于NaYF4∶Yb,Er UCNPs的UICA，并將其用于環(huán)境樣品和農(nóng)產(chǎn)品中氯噻啉的定量檢測(cè)。此檢測(cè)方法結(jié)合了UCNPs和ICA的優(yōu)點(diǎn)，具有操作簡(jiǎn)單、 檢測(cè)時(shí)間短和抗樣品基質(zhì)干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)條件優(yōu)化后，其抑制中濃度(IC50)為97.37 ng/mL，檢出限(IC10)為26.30 ng/mL，線性范圍(IC10～I(xiàn)C90)為26.30～363.08 ng/mL。UICA對(duì)田水、 土壤、 梨、 桃、 小麥、 黃瓜、 番茄、 大米等添加樣品的平均添加回收率為71.8%～97.2%，對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果與HPLC法相符，且具有較高的相關(guān)性。結(jié)果表明，本檢測(cè)方法可作為環(huán)境樣品和農(nóng)產(chǎn)品中氯噻啉殘留的定量檢測(cè)工具。如果能夠研發(fā)出便攜式上轉(zhuǎn)換熒光檢測(cè)設(shè)備，UICA將可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)、 快速的定量檢測(cè)，從而對(duì)保障環(huán)境和食品安全起到更好的促進(jìn)作用。

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