不同保存條件對血中乙醇含量穩(wěn)定性的影響

楊廣麗 ，李小波 ，孫巖 ，鄧嘉敏 ，楊麗玲 ，周湘君

(1、廣東康怡司法鑒定中心，廣東 東莞 523000；2、廣東金域法醫(yī)物證司法鑒定所，廣東 廣州 510000；3、東莞市第五人民醫(yī)院，廣東 東莞 523000；4、廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 東莞 523000)

酒后駕車為交通事故的一大“殺手”[1-3]，長期大量飲酒會造成心、腦、肝、腎、周圍神經(jīng)的損害，引起酒精中毒、出現(xiàn)幻覺、人格障礙等精神癥狀[4]。新《交通法》的實施使酒駕檢測更日漸普遍[5，6]，而最能反映是否酒駕的標(biāo)準(zhǔn)是血液乙醇含量，因此實驗室檢測的結(jié)果是否準(zhǔn)確，關(guān)系到司法判定的正確性及公正性。由于乙醇具有很強的揮發(fā)性，血樣檢測應(yīng)當(dāng)越快越好。但在實際檢案中，由于肇事現(xiàn)場的各種復(fù)雜因素導(dǎo)致樣本送檢被延誤或保存不當(dāng)，或樣本存放一段時期后因案件需要須復(fù)檢的，故對于樣本的檢測時機、保存方式以及復(fù)檢時反復(fù)凍融等因素是否會引起乙醇含量改變而影響司法判定，筆者仍存在困惑。為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，對樣本中乙醇含量的穩(wěn)定性研究是非常有必要的。由于樣本的保存溫度一直存在爭議[7，8]，而關(guān)于光照和解凍時間是否會影響乙醇含量穩(wěn)定性目前尚未有文獻報道，筆者意在通過檢測不同保存方式（溫度、時間、光照以及解凍時長）下乙醇的含量變化情況以確定影響其穩(wěn)定性的因素，為樣本的保存方式提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 空白溶液 空白血液。

1．1．2 叔丁醇內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取叔丁醇2．5126g于500ml容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，得叔丁醇內(nèi)標(biāo)儲備液；精密量取叔丁醇內(nèi)標(biāo)儲備液8．0ml于1000ml容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，作為叔丁醇內(nèi)標(biāo)溶液。

1．1．3 對照品溶液 乙醇標(biāo)準(zhǔn)品（Cerilliant Corporation，濃度：10mg/100ml、20mg/100ml、50mg/100ml、80mg/100ml、100mg/100ml、200mg/100ml、300mg/100ml）。

1．1．4 供試品溶液 精密稱取無水乙醇 0．2002g于250ml容量瓶中，用空白血液定容至刻度，搖勻，得80mg/100ml乙醇供試品溶液。

1．2 儀器與試劑

1．2．1 儀器 Agilent 7890A氣相色譜儀，附 FID檢測器 （安捷倫科技有限公司）；Agilent 7694E自動頂空進樣器（安捷倫科技有限公司）；QL-500氫氣發(fā)生器（山東賽克賽斯氫能源有限公司）；AG系列空氣發(fā)生器（濟南格潤實驗儀器有限公司）；Sartorius BS124S電子天平 （德國賽多利斯集團）；PURELAB Ultra超純水儀（威立雅水處理技術(shù)有限公司）；硅橡膠墊 （安捷倫科技有限公司，批號：00230064）；鋁帽 （安捷倫科技有限公司，批號：0000970929）。

1．2．2 試劑 無水乙醇、叔丁醇 （色譜純，純度≥99．9%）購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙醇 標(biāo) 準(zhǔn) 品 （10mg/100ml、20mg/100ml、50mg/100ml、80mg/100ml、100mg/100ml、200mg/100ml、300mg/100ml）購自 Cerilliant Corporation；超純水(18．2MΩ)由超純水儀(PureSure純水系統(tǒng))制備。

1．3 方法

1．3．1 色譜條件 色譜柱 DB-624 （30m×0．32mm×1．8um 柱），柱溫 40℃，進樣口溫度 150℃，檢測器溫度250℃，氮氣流量25ml/min，氫氣流量30ml/min，空氣流量300ml/min。

1．3．2 頂空自動進樣條件 頂空瓶預(yù)熱溫度70℃，定量環(huán)溫度80℃，傳輸線溫度90℃，循環(huán)時間1．0min，頂空瓶加熱平衡時間 6．0min，頂空瓶加壓時間 0．20min，定量圈定量時間 0．20min，定量圈平衡時間 0．05min，進樣時間 1．00min。

1．3．3 專屬性實驗 分別精密移取叔丁醇內(nèi)標(biāo)溶液0．50ml于 3 個 10ml頂空進樣瓶中，依次加入“1．1”項下空白溶液、80mg/100ml乙醇對照品溶液及供試品溶液0．10ml，加蓋密封，按上述實驗條件測定。

1．3．4 重復(fù)性實驗 分別精密移取叔丁醇內(nèi)標(biāo)溶液0．50ml于6個10ml頂空進樣瓶中，依次加入供試品溶液0．10ml，密封，按上述實驗條件測定。

1．3．5 氣密性實驗 分別精密移取叔丁醇內(nèi)標(biāo)溶液0．50ml于60個10ml頂空進樣瓶中，依次加入供試品溶液0．10ml，硅橡膠墊和鋁帽密封，輕緩搖勻， 在室溫的條件下分別放 置 0．0h、0．5h、1．0h、1．5h、2．0h、2．5h、3．0h、3．5h、4．0h、4．5h、5．0h、6．0h、7．0h、8．0h 和 9．0h 后再進樣，每個時間點做 3 個平行樣，監(jiān)測其含量的變化情況。

1．3．6 光照實驗 在室溫條件下分別取供試品溶液5．0ml置于2個5ml的容量瓶中，分為光照組和避光組，同法操作，每隔2h頂空進樣，每個時間點做3個平行樣，記錄8h之內(nèi)乙醇含量的變化情況。

1．3．7 不同保存溫度和保存時長實驗 分別取供試品溶液1．0ml于90個1．5ml的離心管中，將這90個離心管隨機分成3組，每組30個，分別在室溫（24-28℃）、冷藏（4℃）和冷凍（-20℃）條件下保存30d，各組每天檢測一個樣本，每個樣本做3個平行樣，冷凍樣本至少冷凍24h，且做樣前要提前解凍，記錄各樣本含量的變化情況。

1．3．8 解凍時長實驗 分別取供試品溶液 5．0ml置于6個5ml的容量瓶中，冷凍樣本至少冷凍24h。記錄樣本在室溫條件下自然解凍 0．5h、1．0h、1．5h、2．0h、2．5h、3．0h、3．5h、4．0h、4．5h、5．0h、6．0h、8．0h 和10．0h乙醇含量的變化情況，每個時間點做3個平行樣。

1．4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20．0統(tǒng)計軟件進行重復(fù)測量方差分析和配對t檢驗，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0．05 表示差別有統(tǒng)計學(xué)意義。多變量方差分析先進行Mauchly的球形度檢驗，若P＜0．001，則采用Huynh-Feldt調(diào)整后的F值和P值。

2 結(jié)果

2．1 專屬性實驗 由圖1可以看出，在上述條件下，各色譜峰分離度均達基線分離（R＞1．5），且峰形尖銳美觀，無雜峰干擾。根據(jù)中華人民共和國公共安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《生物樣品血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、異丙酮和正丁醇的頂空-氣相色譜檢驗法》（GA/T 1073-2013）[9]中規(guī)定，檢材與校準(zhǔn)樣或控制樣的保留時間偏差應(yīng)小于2%。結(jié)果表明，該供試品溶液符合要求，由此可確定供試品溶液中含有乙醇成份，乙醇出峰時間為3．5min，叔丁醇出峰時間為5．1min。

2．2 重復(fù)性實驗 按上述實驗條件測定，結(jié)果表明，其RSD＜2%，重復(fù)性良好。

圖1 氣相色譜圖A.空白溶液；B.對照品溶液；C.供試品溶液

2．3 氣密性實驗 對室溫的條件下放置9h內(nèi)樣本中乙醇含量變化情況進行單方向方差分析，如表1所示，各時間點測量值在統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異（P＞0．05），說明室溫條件下硅橡膠墊和鋁帽密封放置9h內(nèi)氣密性良好。

表1 氣密性實驗（mg/100ml）

2．4 光照實驗 對8h之內(nèi)光照組和避光組中乙醇含量變化情況進行配對t檢驗分析，結(jié)果如表2所示：8h之內(nèi)光照與否對乙醇含量無影響 （均有P＞0．05）。

2．5 不同保存溫度和保存時長實驗 對30d內(nèi)室溫組、冷藏組和冷凍組中乙醇含量變化情況進行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表3。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，①整體比較：Mauchly 的球形度檢驗 P＜0．001， 拒絕球形假設(shè)，采用H-F調(diào)整P值（表3），結(jié)果提示不同保存時間點的乙醇含量變化很大，不同保存溫度對乙醇含量也有影響，且時間和溫度之間有交互作用（均有 P＜0．001），其交互效應(yīng)輪廓圖見圖 2。②不同時間點比較（組內(nèi)）：各溫度組的不同時間點（1-30天）總體比較發(fā)現(xiàn)（表 3），冷凍組30d之內(nèi)的P=0．25，無統(tǒng)計學(xué)差異，說明樣本中乙醇在冷凍時保存穩(wěn)定；而室溫和冷藏下不同時間點有統(tǒng)計學(xué)差異（均有P＜0．001）。將室溫組和冷藏組的不同時間點與初始濃度（第1d）相比，發(fā)現(xiàn)室溫組7d內(nèi)乙醇含量穩(wěn)定（均有 P＞0．05），第 8d開始隨時間呈下降趨勢（均有 P＜0．05），而冷藏組乙醇含量變化初期相對平緩（19d 內(nèi)均有 P＞0．05），第 20d 起乙醇含量也隨時間呈下降趨勢（均有 P＜0．05）（圖 2）。③不同保存溫度比較（組間）：各時間點的不同溫度間（室溫、冷藏、冷凍）相互比較結(jié)果顯示（表3），各溫度組7d內(nèi)的P值均大于0．05，在統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異，說明7d內(nèi)溫度對乙醇含量影響很??；而第8d起各溫度組間均有P＜0．05，有統(tǒng)計學(xué)差異，表示第8d后乙醇含量在不同保存溫度下變化很大。將第8d后各溫度組兩兩比較發(fā)現(xiàn)，8-19d內(nèi)室溫組含量明顯低于另兩組（均有 P＜0．05），冷藏和冷凍含量無差別（P＞0．05）；20-27d 內(nèi)含量室溫組＜冷藏組＜冷凍（均有 P＜0．05），28-30d 內(nèi)室溫組與冷藏組無差別（P＞0．05），冷凍組含量仍然穩(wěn)定。

表2 光照實驗（mg/100ml）

圖2 保存溫度和時間交互效應(yīng)輪廓圖

2．6 解凍時長實驗 對室溫條件下自然解凍10．0h之內(nèi)樣本中乙醇含量變化情況進行單因素重復(fù)測量方差分析，如表4所示：冷凍狀態(tài)下解凍0．5h時樣本中可見冰塊狀，仍有部分溶液未完全解凍，其乙醇含量與同組最終濃度 （解凍10．0h）相比P＜0．05，解凍1．0h時樣本外壁仍可感覺到明顯的冰凍感，冷凍4組-6組的乙醇含量與同組最終濃度（解凍 10．0h）相比 P＜0．05，而解凍 1．5h 以后樣本中未見冰塊狀且無冷凍感，各時間點間兩兩比較均有P＞0．05，說明樣本在解凍1．5h后乙醇含量相對穩(wěn)定。

3 討論

3．1 供試品濃度的選擇 李萱等[10]認為當(dāng)乙醇的初始濃度較高或較低時，對乙醇穩(wěn)定性影響較大。而80mg/100ml的乙醇濃度是評判酒駕還是醉駕的標(biāo)準(zhǔn)[11，12]，故為選擇具有代表性的初始濃度且又減少初始濃度對其穩(wěn)定性的影響，本次實驗選擇80mg/100ml乙醇供試品溶液作為樣本。

3．2 氣密性對乙醇含量的影響 乙醇具有揮發(fā)性，且易氧化反應(yīng)生成乙醛[13，14]，因此容器的氣密性可能會引起乙醇含量變化。在實際工作中樣本配制完后經(jīng)常會存在因樣本數(shù)量過多而不能立即檢驗的情況，故本文對此進行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)室溫放置9h乙醇含量無變化，說明硅膠墊和鋁帽在9h之內(nèi)氣密性良好。

3．3 光照對乙醇含量的影響 采血管一般為無色透明的玻璃管或塑料管，血液采集過程中或樣本送檢過程中避免不了會暴露在光照中，故光照也可能是影響因素之一。本實驗結(jié)果顯示8h之內(nèi)有無光照對乙醇含量無影響，說明8h之內(nèi)光照與否不是影響乙醇含量穩(wěn)定性的因素。

3．4 不同保存溫度和保存時長對乙醇含量的影響乙醇容易被微生物污染，在微生物作用下既可新生又可損耗乙醇[15-17]，而微生物的生成受溫度影響較大[18-20]，故溫度是影響樣本乙醇含量穩(wěn)定性因素之一。實驗結(jié)果顯示室溫和冷藏條件下乙醇含量會隨時間而變化，室溫下7d內(nèi)乙醇含量穩(wěn)定，冷藏下19d內(nèi)穩(wěn)定，而冷凍條件下可穩(wěn)定保存30d。有文獻報道[21]冷藏樣本存儲14d后乙醇含量出現(xiàn)明顯下降，與本文結(jié)果有所出入，考慮可能是由于本實驗初便將同一樣本分裝成90份存放，各組每天檢測一份樣品，不存在反復(fù)開瓶凍融情況，從而避免了因開瓶凍融次數(shù)過多而導(dǎo)致乙醇含量降低的現(xiàn)象，檢測結(jié)果更為全面和接近真實情況。

3．5 解凍時長對乙醇含量的影響 筆者在日常的司法檢測過程中經(jīng)常會存在樣本需重新鑒定的現(xiàn)象，所以解凍時間的長短對樣本檢測結(jié)果也存在影響。研究表明冷凍樣本解凍0．5h時與真實值偏相差較大，解凍1．0h時部分樣本含量與真實值依舊相差較大，而解凍1．5h后乙醇含量接近真實值，考慮可能是1．0h內(nèi)樣本還沒有完全解凍，乙醇分配不均勻所致。

表3 不同保存條件對樣本中乙醇濃度的影響（mg/100ml）

表4 冷凍樣本（-20℃）在室溫條件下解凍時長對乙醇含量的影響（mg/100ml）

本實驗方法線性良好，校正曲線y=0．0464580x-0．00379693， 相關(guān)系數(shù)為 0．99998，線性范圍(10-300)mg/100ml，檢測限為 0．51mg/100ml，定量限為1．45mg/100ml，精密度和重復(fù)性實驗的RSD均小于2%，為本次實驗的進行奠定了良好的基礎(chǔ)，使檢測結(jié)果更為科學(xué)。通過在不同的保存溫度、保存時長、有無光照以及不同解凍時長下檢測乙醇的含量變化情況，發(fā)現(xiàn)保存溫度、保存時長和解凍時長對乙醇含量影響較大。7d內(nèi)樣本均可保存在室溫、冷藏和冷凍條件中，19d之內(nèi)可保存在冷藏和冷凍條件中，而30d之內(nèi)最佳的保存條件是冷凍，冷凍后的樣本最短解凍時長為1．5h。

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