3種秸稈腐熟劑微生物組成及其腐熟效果

孫 旭， 汝超杰， 蘇良湖， 陳玉東， 趙克強， 張龍江， 蔡金傍

(1.南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210023； 2.環(huán)境保護部南京環(huán)境科學(xué)研究所，江蘇南京 210042； 3.河海大學(xué)環(huán)境學(xué)院，江蘇南京 210098)

通信作者：蔡金傍，博士，副研究員，從事農(nóng)村環(huán)境污染防治研究。E-mail：jinbangcai@126.com。

我國農(nóng)作物秸稈的年產(chǎn)量在7億t左右，利用率僅為78%，約2億t秸稈隨意堆放在田間地頭或焚燒，造成了巨大的資源浪費和環(huán)境污染[1]。秸稈腐熟劑可加速秸稈中有機物的降解，發(fā)酵的有機肥施入農(nóng)田中可增加土壤有機質(zhì)含量，提高農(nóng)作物抵御病害能力，加快農(nóng)作物秸稈的資源化利用，減少秸稈焚燒帶來的環(huán)境污染[2-3]。目前，我國生產(chǎn)秸稈腐熟劑的企業(yè)約有130余家，登記的腐熟劑產(chǎn)品有40個左右，而作為腐熟劑的菌種則達40種，涵蓋細菌、真菌和放線菌[4]。經(jīng)農(nóng)業(yè)部土壤有機質(zhì)提升補貼項目的實施，秸稈腐熟劑已有大量的應(yīng)用，但存在腐熟劑種類多、菌種數(shù)量不足、菌種穩(wěn)定性差、堆肥效果不理想的問題，不利于秸稈腐熟劑的推廣與應(yīng)用。以前對秸稈腐熟劑的研究大多集中在菌種篩選及腐熟性能方面，而對菌種組成與腐熟效果之間關(guān)系的研究較少[5-7]。針對秸稈腐熟劑在使用過程中存在的問題，本研究以3種秸稈腐熟菌劑為研究對象，考察秸稈腐熟菌劑的菌種組成以及對玉米秸稈的腐熟效果，為秸稈腐熟菌種篩選以及腐熟劑的推廣提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)，具有一定的理論和應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米秸稈和牛糞分別由南京六合勤豐秸稈有限公司和江蘇鎮(zhèn)江三明生物有限公司提供，基本性質(zhì)見表1。秸稈腐熟劑為康源綠洲有機肥發(fā)酵菌劑、宜春堆肥腐熟劑、南華千牧EM菌劑，3種秸稈腐熟劑均為粉末狀固體。

1.2 腐熟劑微生物組成分析

表1 玉米秸稈和牛糞的基本特性

秸稈腐熟劑微生物數(shù)量采用平板稀釋法測定[8]。腐熟劑微生物組成采用高通量測序技術(shù)進行分析，按照Fast DNA試劑盒的操作說明提取腐熟劑基因組DNA，用引物338F/806R和817F/1 196R分別對細菌和真菌16S/18S rDNA基因進行PCR擴增[9]。將PCR產(chǎn)物純化后送上海美吉公司進行Illumina Miseq測序，分別獲得細菌、真菌16S/18S rDNA基因58 483、53 391條原始序列，去掉長度小于300 bp、含模糊堿基和引物堿基2個以上錯配、單堿基重復(fù)超過6個的低質(zhì)量序列后分別得到34 512、25 393條高質(zhì)量序列，將獲得的序列上傳至核糖體數(shù)據(jù)庫項目分類器[(RDP，ribosomal database project) classifier]，得到細菌和真菌的分類信息。本研究中Illumina Miseq測序獲得的序列在NCBI Sequence Read Archive(SRA)上的登錄號為SRX2010874。

1.3 堆肥試驗

2015年8月4—30日在環(huán)保部南京環(huán)境科學(xué)研究所，將18.0 kg玉米秸稈和2.0 kg牛糞混勻，調(diào)節(jié)含水率為70%，C/N 約為29，平均分裝到4個73 cm×53 cm×44 cm的180 L塑料整理箱中，設(shè)置1個對照(CK)和3個秸稈腐熟劑處理組，各腐熟劑分別以0.2%的量接入堆體進行25 d的秸稈腐熟試驗，于腐熟后0、5、10、15、20、25 d取發(fā)酵物于-20 ℃下保存。

每天14：00用溫度計監(jiān)測堆體四周及中間區(qū)域30 cm深處的溫度，取平均值作為堆體溫度；取3 g堆肥樣品，按照 1 ∶10 加入蒸餾水，充分振蕩、離心后測定上清液pH值；將烘干至恒質(zhì)量的樣品在600 ℃馬弗爐中灼燒3 h后稱質(zhì)量，計算揮發(fā)性固體物(VS)含量；采用CHN-O-Rapid元素分析儀測定堆肥樣品的C/N；種子發(fā)芽指數(shù)(GI)參考竹江良的方法[10]進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果以“平均值±標準差”表示，采用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)方差分析(One-way ANOVA)檢驗處理間差異顯著性，用Duncan’s法進行多重比較(P<0.05水平差異顯著，P>0.05水平差異不顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐熟劑微生物組成

2.1.1 腐熟劑微生物數(shù)量 3種秸稈腐熟劑中活菌數(shù)為 3.33×1010～19.13×1010CFU/g(表2)，符合GB 20287—2006《農(nóng)用微生物菌劑》的標準，細菌是優(yōu)勢微生物，約占活菌總數(shù)的 99.9%，南華腐熟劑中細菌數(shù)量可達19.13×1010CFU/g，分別是康源和宜春腐熟劑細菌數(shù)量的5.74、4.00倍。腐熟劑中真菌和放線菌數(shù)量占活菌總數(shù)的0.1%不到，其中康源腐熟劑真菌數(shù)量最多，宜春腐熟劑放線菌數(shù)量最多，而南華腐熟劑中真菌和放線菌數(shù)量最少(表2)。

表2 3種秸稈腐熟劑微生物數(shù)量

注：n=3；同列數(shù)據(jù)后不同的字母表示在0.05水平上差異顯著。

2.1.2 腐熟劑微生物組成 為了解腐熟劑中微生物組成，采用高通量測序方法對腐熟劑中細菌和真菌種類進行分析，在97%相似度水平下分別將細菌、真菌序列統(tǒng)一測序深度至 8 000、6 000，細菌和真菌的分類信息如表3所示，3種秸稈腐熟劑中細菌和真菌種類存在明顯差異，細菌序列可分為13門28綱54屬，主要分布在厚壁菌門芽孢桿菌綱，相對豐度為90.5%～96.4%?？翟锤靹┲饕阅c球菌(Enterococcus)為主，與屎腸球菌(Enterococcusfaecium)相似度達到99%；宜春腐熟劑則以芽孢桿菌(Bacillus)和側(cè)孢芽孢桿菌(Brevibacillus)為主，南華腐熟劑以魏斯式菌(Weissella)和芽孢桿菌為主。真菌序列主要是子囊菌門酵母菌綱酵母菌(Saccharomyces)，與釀酒酵母(S.servazzii)相似度達到100%，相對豐度在80.62%～99.76%。

表3 3種腐熟劑微生物組成

2.2 腐熟劑腐熟效果

2.2.1 腐熟過程中的溫度變化 溫度是玉米秸稈腐熟程度的一個重要表征參數(shù)，不同腐熟劑對玉米秸稈腐熟溫度的影響如圖1所示，添加腐熟劑有助于提高玉米秸稈腐熟的最高溫度以及延長高溫階段(>45 ℃)持續(xù)時間。不加腐熟劑的玉米秸稈最高腐熟溫度為42 ℃，并未進入高溫腐熟階段。而添加康源、宜春、南華腐熟劑后，玉米秸稈的最高腐熟溫度分別達到51、45、56 ℃，高溫腐熟階段分別維持在5、1、5 d。堆體溫度在50 ℃以上保持5～7 d，是保證堆肥達到衛(wèi)生學(xué)指標和腐熟的必要條件，添加康源和南華腐熟劑的堆肥均能滿足堆肥衛(wèi)生指標的要求，其中南華腐熟劑對玉米秸稈的高溫降解更徹底。

2.2.2 腐熟過程中pH值的變化 pH值是影響微生物活性的主要因子之一。如圖2所示，玉米秸稈腐熟過程中pH值呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，腐熟初期上升最快，添加康源和南華腐熟劑的玉米秸稈pH值高于對照的pH值，而添加宜春腐熟劑的玉米秸稈pH值低于對照的pH值，可能是由于接種康源和南華腐熟劑加速了玉米秸稈的礦化，產(chǎn)生大量的NH3，從而導(dǎo)致pH值的增加。到25 d時各處理組的pH值在8.4～8.8之間，符合堆肥腐熟pH值在8.0～9.0的要求。

2.2.3 腐熟過程中揮發(fā)性固體物含量的變化 腐熟過程中揮發(fā)性固體物質(zhì)的變化可以反映玉米秸稈中有機質(zhì)的降解情況，結(jié)果如圖3所示。添加腐熟劑處理堆肥的VS含量均低于對照處理，表明3種腐熟劑均能促進玉米秸稈有機質(zhì)的降解。其中，康源和南華腐熟劑對玉米秸稈的降解效果較好，經(jīng)過25 d的腐熟，VS含量分別減少到69.45%和69.14%。

2.2.4 腐熟過程中C/N的變化 玉米秸稈腐熟過程中C/N的變化如圖4所示，添加腐熟劑處理組的C/N在腐熟后5 d已降至20以下，而對照組則需要15 d的時間；經(jīng)25 d腐熟后，4個處理組C/N在13.43～14.22之間，且已完全腐熟。表明3種腐熟劑均能促進玉米秸稈腐熟，縮短達到腐熟的時間，3種腐熟劑對玉米秸稈腐熟過程中C/N沒有明顯影響。

2.2.5 腐熟過程中GI的變化 種子發(fā)芽指數(shù)(GI)常被用來測定堆肥的生物毒性，是表征堆肥腐熟水平的重要生物學(xué)指標之一。不同處理組的GI值呈先下降后上升的趨勢(圖5)，在腐熟后5 d時4個處理組GI值均低于70%，添加腐熟劑組GI值均低于對照組，這可能是由于接種腐熟劑后加快有機質(zhì)的降解，產(chǎn)生了較多的有毒物質(zhì)(氨和低級脂肪酸等)，抑制了水堇種子的發(fā)芽。在腐熟后15 d時添加腐熟劑組GI值均大于80%，而對照組GI值在腐熟后20 d才達到80%，經(jīng)過25 d腐熟，4個處理組的GI值由高到低的順序為南華>康源>宜春>對照，表明添加腐熟劑有助于降低秸稈腐熟發(fā)酵物植物毒性，加快堆肥腐熟進程。

3 討論

秸稈腐熟劑的菌種組成通常決定了腐熟劑的腐熟效果，因此本研究隨機選取3種秸稈腐熟菌劑，考察其菌種組成以及對玉米秸稈的腐熟效果。以前對秸稈腐熟劑成品的研究主要集中在腐熟特征及腐熟劑篩選上，而對菌種組成與腐熟效果之間關(guān)系的研究較少，尤其是采用高通量測序方法研究腐熟劑菌種組成還鮮有涉及[5-7，11-12]。本研究通過平板計數(shù)及焦磷酸測序得到的細菌(13門和54屬)和真菌(1門和1屬)分類結(jié)果顯示，3種腐熟劑均由多種微生物菌種復(fù)合而成，以細菌為主、真菌和放線菌為輔，細菌的種類多于真菌，腐熟劑中有效活菌數(shù)量達到5.5×1010～19.1×1010CFU/g，與前人的研究結(jié)果[13]一致。與克隆文庫相比，高通量測序方法能反映腐熟劑中更多的微生物信息，本研究中康源腐熟劑中腸球菌序列與屎腸球菌相似度達到99%，屎腸球菌雖然是一種發(fā)酵能力較強的菌株，但也是一種條件致病菌，存在潛在環(huán)境風險[12，14-15]。宜春和南華腐熟劑中細菌主要是芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、魏斯式菌，這些菌株對玉米和水稻秸稈具有很強的降解能力[16-17]。3種腐熟劑中真菌種類較為單一，以釀酒酵母為主，其常作為廚余垃圾堆肥初期的接種菌劑，有助于加速堆肥的進行[18]。

為了驗證3種腐熟劑對玉米秸稈的腐熟效果進行 25 d 的腐熟試驗，結(jié)果表明，3種腐熟劑均能促進玉米秸稈腐熟升溫，延長高溫階段持續(xù)時間，降低揮發(fā)性固體物質(zhì)和C/N，減少腐熟物的植物毒性，縮短腐熟時間，加快腐熟進程。大量的研究表明，在自然堆肥初期接種微生物菌劑能增加堆肥初期微生物數(shù)量，提高微生物代謝活性，加快有機物的降解，促進堆料的腐熟，例如在堆肥初期接種芽孢桿菌和鏈霉菌，可在堆肥過程中增加細菌數(shù)量，加速有機質(zhì)分解[19]；接種EM菌劑有利于堆肥礦化作用，縮短堆肥腐熟時間5～8 d[20]。但也有學(xué)者認為，接種的外源微生物在與土著微生物競爭過程中處于劣勢，難以形成優(yōu)勢菌，所以沒有必要接種微生物菌劑[21]。

3種腐熟劑以南華腐熟劑對玉米秸稈的腐熟效果最好，接種南華腐熟劑處理組升溫最快，高溫維持時間最長，VS含量降低得最多，GI值最高，這可能與接種腐熟劑的有效活菌數(shù)量和種類有關(guān)。在同等接種量下，南華腐熟劑中有效活菌數(shù)量可達19.13×1010CFU/g，分別是康源和宜春腐熟劑細菌數(shù)量的5.74、4.00倍左右，可以增加腐熟初期微生物數(shù)量。南華腐熟劑中細菌主要是芽孢桿菌和魏斯式菌，真菌以酵母菌為主，這類微生物是常用的秸稈腐熟菌種，能產(chǎn)生纖維素酶、半纖維素酶類、葡聚糖酶等多種消化酶，對纖維素類的秸稈具有較強的降解能力，在有機肥制備、廚余垃圾處理以及環(huán)境凈化方面有廣泛的應(yīng)用[22-23]。

4 結(jié)論

本研究表明，接種腐熟劑有助于促進玉米秸稈的腐熟，由于不同的腐熟劑中微生物種類不同，對堆肥腐熟程度的影響存在差異，為接種的微生物菌劑提供菌種資源，主要結(jié)論如下：(1)3種秸稈腐熟劑均為細菌、真菌、放線菌復(fù)合而成的微生物菌劑，有效活菌數(shù)由高到低依次為南華>宜春>康源，細菌是優(yōu)勢微生物；(2)3種腐熟劑真菌以釀酒酵母為主，細菌組成存在明顯差異，康源腐熟劑中細菌主要是腸球菌，宜春腐熟劑中細菌以芽孢桿菌和側(cè)孢芽孢桿菌為主，南華腐熟劑則以魏斯式菌和芽孢桿菌為主，康源腐熟劑存在潛在的環(huán)境風險；(3)3種腐熟劑均能促進玉米秸稈腐熟，縮短腐熟時間，達到無害化標準，其中南華腐熟劑更有利于玉米秸稈的分解，腐熟效果更好。

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