與番茄果實顏色連鎖的InDel標(biāo)記及其應(yīng)用

王仁漢， 李文麗， 王 富， 王 輝

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山東青島 266109)

番茄(Solanumlycopersicon)屬于茄科番茄屬，是世界范圍內(nèi)廣泛種植的蔬菜作物之一。番茄果實色澤是葉綠素、類胡蘿卜素、類黃酮和花青苷等多種色素的綜合表現(xiàn)[1]，隨著果實發(fā)育代謝過程中相關(guān)色素含量及組分的變化，果實顏色表現(xiàn)出差異性，類胡蘿卜素中的番茄紅素在果實顏色形成中具有決定性作用[2-4]。番茄果實顏色受到很多基因控制，現(xiàn)已研究發(fā)現(xiàn)至少有9個基因位點(r、t、B、Del、dg、hp、ogc、MOB等)對番茄的果實顏色有很大的影響[5-8]。近年來，有研究證實MYB轉(zhuǎn)錄因子在番茄果實顏色形成中發(fā)揮決定性作用[9]。黃三文等研究發(fā)現(xiàn)，在粉果番茄SIMYB12基因起始密碼子上游4 kb處存在大小為603 bp的DNA序列缺失，并開發(fā)為InDel標(biāo)記InDel-P[10]。本研究利用與番茄果實顏色相關(guān)的InDel-P分子標(biāo)記對4份紅果番茄高代自交系和4份粉紅果番茄高代自交系進(jìn)行PCR檢測，隨后對48份后代材料進(jìn)行PCR檢測，試圖驗證InDel-P標(biāo)記是否可用于番茄果實顏色分子標(biāo)記輔助篩選，進(jìn)而加快番茄果實色澤選育進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料取自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院番茄育種田，共計56份。紅果番茄高代自交系4份，編號P1～P4，粉紅果番茄高代自交系4份，編號P5～P8。待檢測分離后代番茄材料計48份，其中編號1～24為粉紅果普通番茄，編號25～28、45～48為紅果普通番茄，編號33～38為黃果櫻桃番茄，編號39～44為粉紅果櫻桃番茄。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 鑒定番茄果實顏色相關(guān)的InDel分子標(biāo)記的引物參照黃三文等提供的序列[10]合成；引物序列見表2，所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 鑒定所用的特異性引物信息

1.2.2 番茄樣品DNA的提取純化及檢測 使用北京天根生物科技有限公司植物DNA提取試劑盒提取樣品DNA，提取方法參照試劑盒說明書。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。

1.2.3 PCR擴增反應(yīng) PCR反應(yīng)體系：模板DNA(20～80 ng/μL)5.0 μL，10×PCR Buffer(含Mg2+)2.5 μL，高純dNTPs(2.5mmol/L)2.0μL，引物F/R(10μmol/L)各1.0 μL，easyTaqDNA polymerase(5 U/μL)0.3 μL，ddH2O補足 20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min；4 ℃保存。取PCR擴增產(chǎn)物約10 μL，在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢查PCR擴增結(jié)果，自動凝膠成像系統(tǒng)觀察照相，記錄電泳結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗樣品DNA質(zhì)量檢測

提取的DNA電泳條帶明亮整齊(圖1)，符合PCR分析要求。紫外分光光度計檢測樣品濃度D260 nm/D280 nm<2.0，取5.0 μL DNA母液稀釋至約40 ng/μL用于PCR擴增。

2.2 與番茄果色性狀相關(guān)的標(biāo)記在8份已知果色的高代自交系中的驗證

利用與番茄果實顏色相關(guān)的標(biāo)記InDel-P對8份已知果色的番茄高代自交系中的PCR擴增結(jié)果顯示(圖2)，在4份不同來源的紅果番茄高代自交系中均可擴增出960 bp的特異DNA片段，另外在750、500 bp左右還有2條較弱的非特異性擴增條帶，而在4份不同來源的粉紅果番茄高代自交系中均可擴增出360 bp的特征譜帶， 可見該標(biāo)記能很好地用于區(qū)分紅果番茄和粉紅果番茄材料。

2.3 與番茄果色性狀相關(guān)的標(biāo)記在48份番茄分離后代中的應(yīng)用

為了驗證InDel-P分子標(biāo)記與番茄果色基因間的連鎖關(guān)系，對48份番茄分離后代進(jìn)行PCR驗證試驗，結(jié)果顯示，(圖3)在32份普通番茄中有2份未擴增出條帶，有17份擴增出360 bp的DNA特異性條帶，有9份擴增出960 bp條帶，此外，有4份同時擴增出2條條帶，說明控制果色的基因位點處于雜合的狀態(tài)；16份櫻桃番茄中有11份后代材料擴增出360 bp的特征條帶，分子鑒定結(jié)果為粉紅色；另外5份材料僅擴增出960 bp的特征譜帶，分子鑒定結(jié)果為紅色。針對這48份材料的果實顏色進(jìn)行嚴(yán)格的田間調(diào)查統(tǒng)計，田間調(diào)查結(jié)果(表3)顯示，30份普通番茄中有4份材料(編號為5、6、9、14)的果實顏色與分子鑒定結(jié)果存在出入，16份櫻桃番茄中有6份材料(編號為33、34、35、36、37、38)的果實顏色與分子鑒定結(jié)果存在出入。所涉及的普通番茄材料中分子檢測的準(zhǔn)確率為86.7%，櫻桃番茄材料中的準(zhǔn)確率為62.5%，可見該標(biāo)記可有效地用于普通番茄分子標(biāo)記輔助選擇，而櫻桃番茄的準(zhǔn)確率較低。

表3 供試番茄材料PCR檢測情況

3 小結(jié)

番茄的顏色取決于果肉與果皮的顏色，受很多基因控制，番茄果皮受Y-y等位基因控制，果肉紅、黃和橙等常見的3種顏色由R-r與T-t這2對等位基因控制，T-t基因?qū)τ赗基因起隱性上位作用[11-12]。盡管番茄果實顏色受多個遺傳位點控制，但是控制番茄果皮顏色的Y基因是一個轉(zhuǎn)錄因子SIMYB12在調(diào)控果實顏色方面具有重要作用[9]。黃三文等基于轉(zhuǎn)錄因子基因SIMYB12開發(fā)了與番茄果實顏色密切相關(guān)的InDel標(biāo)記InDel-P[10]，理論上該標(biāo)記可以實現(xiàn)番茄果色的分子標(biāo)記輔助選擇。

本研究對番茄果色性狀相關(guān)的標(biāo)記InDel-P在育種中的應(yīng)用價值進(jìn)行了考察，該標(biāo)記可在普通紅果番茄中同時擴增出960 bp的DNA特異片段，而在普通粉果番茄中僅擴增出360 bp的特異片段。對48份番茄分離后代進(jìn)行PCR檢測和田間鑒定，結(jié)果顯示，普通番茄分子鑒定與田間鑒定的吻合度為86.7%，櫻桃番茄材料中的準(zhǔn)確率為62.5%，可見該標(biāo)記可有效地用于普通番茄分子標(biāo)記輔助篩選，而在櫻桃番茄中的利用效率較低。

轉(zhuǎn)錄因子SIMYB12為控制番茄果皮顏色的Y基因，該基因的表達(dá)導(dǎo)致番茄果皮中積累大量類黃酮而成為黃色，最終使得果肉顏色為紅色的番茄最終呈現(xiàn)紅色，而粉果果皮中該基因不表達(dá)，所以果皮中沒有類黃酮的積累，從而使紅肉果實最終呈現(xiàn)粉色[9-10]。由此可以推斷，黃果番茄果皮中SIMYB12應(yīng)該是表達(dá)的，從而PCR可擴增出960 bp的DNA特異片段，這也基本解釋了5份黃果櫻桃番茄(編號為34～38)分子鑒定表現(xiàn)為紅色的結(jié)論。

本研究中有4份材料分子鑒定結(jié)果顯示SIMYB12基因在這4份材料中處于雜合狀態(tài)，而田間鑒定顏色表現(xiàn)為粉紅色，這不能用紅色對于粉紅為顯性的遺傳規(guī)律進(jìn)行解釋；另外，編號為33的黃果櫻桃番茄果色顏色與分子鑒定顏色之間也無法合理解釋，這些同樣反映了番茄果實顏色遺傳的復(fù)雜性。

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