高效液相色譜法測(cè)定淫羊藿藥材及飲片中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的含量Δ

王世杰，高云佳，周書繁，韓志嶺，張文濤，李為理，姜 勇

(1.遼寧上藥好護(hù)士藥業(yè)(集團(tuán))有限公司研發(fā)部，遼寧 本溪 117000； 2.北京大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，北京 100191)

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿EpimediumbrevicornumMaxim.、箭葉淫羊藿EpimediumsagittatumMaxim.、柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim.或朝鮮淫羊藿EpimediumkoreanumNakai的干燥葉，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨和祛風(fēng)濕的作用，臨床上被用于腎陽(yáng)虛衰、陽(yáng)痿遺精、筋骨痿軟、風(fēng)濕痹痛和麻木拘攣等癥[1]。關(guān)于淫羊藿的質(zhì)量控制，一般是測(cè)定淫羊藿苷或總黃酮的含量，以其含量的高低作為判斷藥材及飲片優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)。這種方法有很大的局限性，不足以全面反映藥材及飲片的質(zhì)量?，F(xiàn)代研究結(jié)果表明，中藥是一個(gè)復(fù)雜體系，其藥理作用是多種成分共同作用的結(jié)果，采用多指標(biāo)成分定量對(duì)其質(zhì)量控制是十分必要的。通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研[2-7]，發(fā)現(xiàn)淫羊藿的主要藥效成分為淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅰ、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C等黃酮苷類化合物。以往對(duì)淫羊藿黃酮類成分的分析方法很多，但仍然存在著不同程度的局限性，如色譜條件不理想、分離度不好、色譜峰的保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)及基線不穩(wěn)等。為了建立淫羊藿藥材及飲片有效的質(zhì)量控制方法，本研究收集了不同產(chǎn)地的淫羊藿藥材及飲片樣品，以朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷等4種主要黃酮苷類成分為指標(biāo)，建立多指標(biāo)成分的含量測(cè)定方法，旨在為今后淫羊藿藥材含量測(cè)定方法的選擇和藥材的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Sartorius BSA124 s型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；Agilent 1100型高效液相色譜儀、VWD G1 314 A型紫外檢測(cè)器[安捷倫科技(中國(guó))有限公司]；KQ 250型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本EYELA)。

1.2 藥品與試劑

17批淫羊藿藥材分別產(chǎn)自甘肅省(批號(hào)：150915—150919、150504、150511、150601—150603、150605—150607)、吉林省(批號(hào)：150705)、遼寧省(批號(hào)：150808、150810)和陜西省(批號(hào)：150815)，12批淫羊藿市售飲片分別產(chǎn)自甘肅省(批號(hào)：160513、160522、160524、160601、160621)、四川省(批號(hào)：160519、160611)、吉林省(批號(hào)：160425、160509、160515)、黑龍江省(批號(hào)：160613)和遼寧省(批號(hào)：160611)，均由遼寧上藥好護(hù)士藥業(yè)(集團(tuán))有限公司提供，經(jīng)北京大學(xué)藥學(xué)院屠鵬飛教授鑒定為淫羊藿EpimediumbrevicornumMaxim.。對(duì)照品：淫羊藿苷(批號(hào)：110737-200415)、朝藿定C(批號(hào)：111780-201503)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；朝藿定A(批號(hào)：MUST-14060312)、朝藿定B(批號(hào)：MUST-14062312)購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司。乙醇、磷酸、甲酸及冰醋酸試劑均為分析純(北京化工廠)；乙腈(天津市彪仕奇科技發(fā)展有限公司)、甲醇(天津市賽孚世紀(jì)科技發(fā)展有限公司)為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.01%磷酸水(V∶V=24 ∶76)，流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，進(jìn)樣量10 μl。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含朝藿定A 0.034 mg、朝藿定B 0.079 mg、朝藿定C 0.14 mg和淫羊藿苷0.217 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取淫羊藿藥材粉末(過(guò)三號(hào)篩，50目)約0.2 g，置于具塞錐形瓶中，加入50%乙醇20 ml，稱定質(zhì)量，超聲1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%乙醇補(bǔ)充減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 測(cè)定結(jié)果

在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。

A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；1.朝藿定A；2.朝藿定B； 3.朝藿定C；4.淫羊藿苷A.reference solution；B.sample solution；1.epimedin A； 2.epimedin B；3.epimedin C；4.icariin圖1 對(duì)照品溶液和供試品溶液的高相液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of the references and samples

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取各對(duì)照品溶液2、4、8、10、12和16 μl進(jìn)樣，測(cè)定各對(duì)照品的峰面積，再分別以各對(duì)照品的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、進(jìn)樣量(g)為橫坐標(biāo)(X)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在線性范圍內(nèi)，各成分線性關(guān)系良好，見(jiàn)表1。

表1 朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的回歸方程Tab 1 Results of the regression equations for epimedins A, B and C and icariin

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液(產(chǎn)地：甘肅省，批號(hào)：150511)，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量10 μl，測(cè)定各色譜峰的峰面積，計(jì)算其RSD。結(jié)果顯示，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.30%、0.08%、1.37%和0.25%，表明本研究所用儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的淫羊藿藥材粉末(產(chǎn)地：甘肅省，批號(hào)：150511)，按供試品溶液制備方法，平行配制6份，分別測(cè)定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的峰面積，計(jì)算相應(yīng)含量。結(jié)果顯示，樣品中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷平均含量分別為0.20%、1.27%、0.29%和0.60%，其RSD分別為0.63%、0.73%、2.23%和0.82%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液(產(chǎn)地：甘肅省，批號(hào)：150511)，分別于 0、2、4、8、12和24 h測(cè)定各色譜峰的峰面積，計(jì)算其RSD。結(jié)果顯示，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的RSD分別為1.08%、0.27%、1.73%和0.71%，表明該供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的淫羊藿藥材粉末(產(chǎn)地：甘肅省，批號(hào)：150511，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的含量分別為0.60%、0.20%、1.27%和0.29%)，精密稱取0.1 g，置于具塞錐形瓶中，按1 ∶1濃度分別精密吸取含朝藿定A 0.2 mg、朝藿定B 1.27 mg、朝藿定C 0.29 mg和淫羊藿苷0.6 mg的各對(duì)照品溶液加入各藥粉中，按供試品溶液的制備方法，制成6份同濃度的供試品溶液。按上述色譜條件檢測(cè)，計(jì)算其回收率，結(jié)果表明，該方法的準(zhǔn)確性良好，見(jiàn)表2。

2.10 檢測(cè)限和定量限的測(cè)定

精密量取已知濃度的對(duì)照品溶液適量，置于10 ml容量瓶中，以乙腈-水(V∶V=24 ∶76)定容至刻度。取該溶液進(jìn)樣10 μl測(cè)定，記錄色譜圖。以信噪比為3 ∶1時(shí)的色譜峰對(duì)應(yīng)的進(jìn)樣量作為最低檢測(cè)限，以信噪比為10 ∶1時(shí)的色譜峰對(duì)應(yīng)的進(jìn)樣量作為最低定量限，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 待測(cè)成分最低檢測(cè)限和定量限(μg)Tab 3 The LOD and LOQ of the analytes(μg)

2.11 樣品的測(cè)定

取17批淫羊藿藥材和12批淫羊藿市售飲片的樣品，按供試品溶液制備方法制備，依法測(cè)定樣品中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的考察

通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研[8-10]并結(jié)合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在流動(dòng)相中加入一定量的酸，可改善黃酮苷類化合物的峰型，減少拖尾現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)考察了不同濃度的甲酸、乙酸、磷酸和三氟乙酸對(duì)各色譜峰的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入磷酸后，色譜圖基線平穩(wěn)，各色譜峰分離良好且峰型無(wú)拖尾。本研究選用等度洗脫，方法更簡(jiǎn)便、省時(shí)。

表4 朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的含量測(cè)定結(jié)果(n=2)Tab 4 Results of the content determination of epimedins A, B and C and icariin(n=2)

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用紫外分光光度法，分別對(duì)朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)上述4個(gè)化合物在270 nm處均有最大吸收，結(jié)合《中華人民共和國(guó)藥典：一部》(2015版)中淫羊藿藥材含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)，最終選擇270 nm為本研究檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 產(chǎn)地對(duì)藥材及飲片質(zhì)量的影響

《中華人民共和國(guó)藥典：一部》(2015版)規(guī)定，淫羊藿藥材中淫羊藿苷的含量不得低于0.5%，其在飲片中的含量不得低于0.4%。本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地的藥材及飲片中淫羊藿苷等成分的含量差異較大，可能與不同地區(qū)的土壤、氣候和環(huán)境等因素有關(guān)。東北三省的淫羊藿藥材中上述4種成分的含量均較低，僅少數(shù)樣品符合《中華人民共和國(guó)藥典：一部》(2015版)的要求；而甘肅省的淫羊藿藥材中淫羊藿苷的含量普遍很高，且朝藿定B、朝藿定C的含量也普遍高于其他地區(qū)的藥材，說(shuō)明該地區(qū)的藥材具有較好的品質(zhì)。因此，在采購(gòu)藥材時(shí)應(yīng)充分考慮地域差異的影響。

《中華人民共和國(guó)藥典：一部》(2015版)中采用紫外分光光度法方法測(cè)定淫羊藿藥材的總黃酮含量，單一指標(biāo)性成分未能實(shí)現(xiàn)對(duì)藥材的全面監(jiān)測(cè)，紫外方法雖實(shí)現(xiàn)了對(duì)總黃酮的測(cè)定，但準(zhǔn)確性不夠好。朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷為淫羊藿中的主要活性成分，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨和祛風(fēng)濕的藥理作用[1]。本研究建立了同時(shí)測(cè)定上述4種主要活性成分含量的高效液相色譜-紫外檢測(cè)方法，為淫羊藿藥材及市售飲片的質(zhì)量控制提供了更加便捷、高效和準(zhǔn)確的方法，為進(jìn)一步提升淫羊藿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了有意義的參考。

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