尖葉假龍膽對酒精性肝損傷大鼠的保護作用

胡曉陽，蔣皓，鄒尚亮，張雙良

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.齊齊哈爾市中醫(yī)醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000；3.河北省滄州中西醫(yī)結合醫(yī)院，河北 滄州 061000)

酒精性肝損傷(Alcoholic Liver Disease,ALD)是指因過量飲酒導致的肝臟病理性損傷[1]。在組織病理學上主要表現(xiàn)為以下4種逐漸遞進的形式：酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化，這4種損傷形式可單獨或混合存在[2-3]。酒精性肝損傷發(fā)病機制相當復雜，因其涉及到酒精與其代謝產(chǎn)物對肝臟產(chǎn)生的直接或間接作用，同時酒精性肝損傷的發(fā)生、進展還與遺傳易感性及營養(yǎng)狀態(tài)密切關聯(lián)。全世界有大約1 500萬～2 000萬人酗酒，這其中就有10%～20%的人發(fā)生酒精性肝損傷[4]。酒精性肝損傷是發(fā)達國家肝硬化的主要致病原因(占80%～90%)，也是導致青壯年死亡的主要原因[5]。近年隨著中國居民生活水平的提高，嗜酒者逐漸增多，酒精性肝損傷的發(fā)生率呈逐年上升的趨勢，酒精已成為繼病毒性肝炎之后導致肝損傷的第二大病因[6-7]，因此對酒精性肝損傷的研究日漸引起人們的廣泛關注。

尖葉假龍膽為龍膽科假龍膽屬下的一個種，也叫苦龍膽，葉披針形，寬3～7 mm；花萼長7～10 mm，萼簡短，花冠長9～12 mm，裂片具流蘇狀副冠。生于濕草地，產(chǎn)于黑龍江、內(nèi)蒙古[8]。該藥味苦，具有清熱、利濕之功，主要在民族醫(yī)學中的藏醫(yī)、蒙醫(yī)學中使用，用于治療黃疸、肝炎、膽囊炎、頭痛、發(fā)熱等疾病，療效顯著?！睹芍菜幹尽酚涊d其為阿古特-其其格，并認為其全草可治黃疸，頭痛，發(fā)熱，口干，未成熟熱，膽熱，并有治療黃疸型肝炎，膽囊炎，心絞痛，發(fā)燒，外傷感染的記載。鄂倫春族用以治療心律失常等心臟病[9]?，F(xiàn)代對于尖葉假龍膽的藥效學研究主要集中在保肝、抗心律失常、抗氧化、降糖、抗心肌纖維化等方面[10-11]?，F(xiàn)代研究證實,尖葉假龍膽具有顯著的抗氧化活性以及對某些代謝酶的調(diào)節(jié)作用，ALD發(fā)病主要是由氧化應激、某些基因的激活參與，因此尖葉假龍膽可能具有防治ALD的功效。

1 材料

1.1 陽性藥液的制備

東寶甘泰片(吉林通化東寶藥業(yè)股份有限公司,批號141203)粉碎后以蒸餾水將其稀釋成0.04 g/ml的溶液，陽性藥組大鼠給藥量為10 ml/kg,相當于臨床成人常用量的6.25倍。

1.2 尖葉假龍膽高、中、低濃度藥液的制備

尖葉假龍膽全草采自黑龍江大興安嶺地區(qū)漠河縣，由黑龍江中醫(yī)藥大學王振月教授鑒定為Gentianellaacuta的全草。尖葉假龍膽全草1 kg粉碎，以75%乙醇20 L浸泡于圓底燒瓶中2 h，加熱回流提取、過濾2次，二次藥液混合，于連接循環(huán)水真空泵的旋轉蒸發(fā)器中減壓濃縮，得尖葉假龍膽浸膏，待用。加蒸餾水稀釋至2 L，相當于含生藥材濃度為0.50 g/ml，此為高濃度；取出1 L加蒸餾水1 L，相當于0.25 g/ml,此為中濃度；取中濃度1 L，加蒸餾水1 L，相當于0.13 g/ml,此為低濃度。

1.3 實驗動物

雄性Wistar大鼠60只，體質量180～220 g，由哈爾濱育英養(yǎng)殖場提供，許可證編號：SCXK(黑)2013-001。將小鼠置于室溫，給予標準的實驗室食物和充足的淡水。遵循國家制定的有關實驗動物保護和使用的指南，并經(jīng)本單位實驗動物倫理委員會批準。

2 方法

2.1 大鼠酒精性肝損傷模型的建立及取材

本實驗采用酒精灌胃法[1]建立大鼠酒精性肝損傷模型。將60只Wistar大鼠隨機分為6組，每組10只，分別是空白組、模型組、陽性藥組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，適應性飼養(yǎng)1周后，除正常喂養(yǎng)外，模型組，陽性藥組，高、中、低劑量組均給予梯度50%乙醇灌胃，即：第1周2 ml/kg,第2周4 ml/kg,第3周6 ml/kg,從第4周開始到第8周結束7 ml/kg；空白組給予等量生理鹽水。第7～8周高、中、低劑量組分別給予相應濃度的尖葉假龍膽稀釋液10 ml/kg,陽性藥組給予東寶肝泰稀釋液10 ml/kg,空白組、模型組給予生理鹽水10 ml/kg。末日晚8時開始禁食水，20%烏拉坦溶液5 ml/kg腹腔注射麻醉后，腹主動脈取血后4 ℃ 3 500 r/min離心10 min，分離血清；取出完整肝臟，生理鹽水洗凈，濾紙吸干后稱重并做記錄，計算肝臟指數(shù)。

肝臟指數(shù)(%)=肝重/體質量×100%

2.2 生化指標的測定

天冬氨酸氨基轉移酶(AST)測定試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號151231)；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)測定試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號152421)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20151014)；谷胱甘肽(GSH)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20151021)。嚴格按照說明書操作。

2.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，結果以均值±標準差表示，數(shù)據(jù)應用單因素方差分析以及Dunnett＇s檢驗，檢驗水準定為α=0.05，P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 尖葉假龍膽對酒精性肝損傷大鼠肝臟指數(shù)的影響

與空白組相比，模型組肝指數(shù)明顯升高(P<0.05)，差異顯著；與模型組相比，陽性藥組、高劑量組、中劑量組、低劑量組肝臟指數(shù)均降低(P<0.05),差異均顯著；與陽性藥組比較，高劑量組、低劑量組肝指數(shù)均降低(P<0.05)，差異顯著，中劑量組肝指數(shù)變化不明顯(P>0.05)，結果見表1。

3.2 尖葉假龍膽對慢性酒精性肝損傷大鼠血清AST、ALT的影響

與空白組相比，模型組大鼠血清ALT濃度明顯升高(P<0.01)，差異極顯著；與模型組相比，陽性藥組、高劑量組、中劑量組、低劑量組大鼠血清ALT濃度均降低(P<0.05)，差異顯著；與陽性藥組相比，高、中、低劑量組ALT濃度均降低(P<0.05)，差異顯著；與高劑量組相比，中劑量組ALT濃度降低(P<0.05)，差異顯著，低劑量組變化不明顯(P>0.05)。

與空白組相比，模型組大鼠血清AST濃度明顯升高(P<0.01)，差異極顯著；與模型組相比，陽性藥組、高劑量組、中劑量組、低劑量組AST濃度均明顯降低(P<0.05)，差異顯著；與陽性藥相比，高劑量組AST濃度降低明顯(P<0.01)，差異極顯著，中劑量組、低劑量組降低明(P<0.05)，差異顯著；與高劑量組相比，中劑量組AST濃度升高明顯(P<0.05)，低劑量組AST濃度降低明顯(P<0.05)，結果見表2。

表1 尖葉假龍膽對酒精性肝損傷大鼠肝臟 指數(shù)的影響

注：與空白組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與陽性藥組相比，ΔP<0.05

表2 尖葉假龍膽對酒精性肝損傷大鼠血清AST、 ALT含量的影響

注：與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，ΔP<0.05；與陽性藥相比，#P<0.05，##P<0.01；與高劑量組相比，☆P<0.05，☆☆P<0.01

3.3 尖葉假龍膽對酒精性肝損傷大鼠肝組織SOD、GSH含量的影響

與空白組相比，模型組SOD活力濃度明顯降低(P<0.01)，差異極顯著；與模型組相比，尖葉假龍膽中劑量組SOD活力濃度明顯升高(P<0.01)，差異顯著，陽性藥組、高劑量組、低劑量組變化不明顯(P>0.05)，差異無統(tǒng)計學意義。

與空白組相比，模型組GSH含量明顯降低(P<0.01)，差異極明顯；與模型組相比，尖葉假龍膽高劑量組GSH含量明顯升高(P<0.01)，差異極顯著，中、低劑量分組變化不明顯(P>0.05)；與尖葉假龍膽高劑量組相比，中、低劑量組GSH含量明顯低(P<0.01，P<0.01)，差異極顯著，結果見表3。

表3 尖葉假龍膽對酒精性肝損傷大鼠肝組織SOD、 GSH活力或含量的影響

注：與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，ΔΔP<0.01；與高劑量組相比，☆☆P<0.01

4 討論

肝指數(shù)為肝臟濕重與大鼠體質量的比值，長期過量飲酒導致酒精性肝損傷時，肝細胞腫脹變大，顯水樣變。當肝臟發(fā)生脂質代謝紊亂后，肝細胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪的淤積，發(fā)生脂肪變，使肝臟體積進一步增大，重量增加；當肝細胞的微管受損傷后，分泌功能受到阻礙，使得分泌性蛋白滯留在細胞內(nèi)，細胞發(fā)生氣球樣變，體積增加，重量也增加，肝指數(shù)升高[12]。從該實驗結果中可以看出，酒精性肝損傷造模成功，高、中、低劑量組肝指數(shù)均較模型組降低，且差異明顯，但尖葉假龍膽各劑量組之間無明顯差異。實驗結果證明：尖葉假龍膽能夠對酒精性肝損傷大鼠肝臟起到保護作用。

轉氨酶的異常升高是肝臟疾病的標志[13]，從各組大鼠肝損傷指標AST、ALT的活性可以看出尖葉假龍膽具有保肝作用，這兩種酶都存在肝細胞內(nèi)，正常情況下在血清中含量很少，當肝臟受到損害，肝細胞膜的通透性增加，大量的AST、ALT釋放入血，引起血中這兩種酶的濃度升高，AST主要分布于肝細胞線粒體內(nèi)，因此除非肝細胞線粒體也受到損傷，否則血清中AST濃度不會升高太多，應用尖葉假龍膽的實驗組大鼠血清中這兩種酶的濃度明顯低于模型組，證明尖葉假龍膽對于增加肝細胞膜的穩(wěn)定性確有作用。ALT與AST主要分布在肝臟的肝細胞內(nèi)，肝細胞壞死時ALT和AST就會升高。谷丙轉氨酶主要存在于肝細胞漿內(nèi),細胞內(nèi)ALT濃度高于血清中1 000～3 000倍,正常時血清的含量很低，當肝細胞受損后，肝細胞膜通透性增加，胞漿內(nèi)的ALT、AST釋放入血漿，使得血清ALT、AST的酶活性升高，只要有1%肝細胞受損，谷丙轉氨酶活性即升高一倍，因此，谷丙轉氨酶被世界衛(wèi)生組織推薦為肝功能損害最敏感的檢測指標,其升高的程度與肝細胞受損的程度相一致，因此是目前最常用的肝功能指標。與ALT不同的是，大約80% AST存在于肝細胞線粒體中[14]，因此，不同類型的肝損傷，ALT和AST升高的程度及其AST/ALT的比值是不一樣的。急性肝炎和慢性肝炎的輕型，雖有肝細胞的損傷，肝細胞的線粒體仍保持完整，故釋放入血的只有存在于肝細胞漿內(nèi)的ALT，所以主要表現(xiàn)為ALT的升高。重型肝炎和慢性肝炎的中型和重型，肝細胞的線粒體也遭到了嚴重的破壞，AST從線粒體和胞漿內(nèi)釋出，因而表現(xiàn)出AST升高多于ALT。肝硬化和肝癌患者，肝細胞的破壞程度更加嚴重，線粒體也受到了嚴重的破壞，因此，AST升高明顯多于AST。酒精性肝病的患者，AST的活性也常常大于ALT。各實驗組ALT活性均降低，說明尖葉假龍膽對肝臟有保護作用，但中、低劑量組效果明顯強于高劑量組；對于AST活性的影響，各實驗組均有降低作用，說明對肝臟具有保護作用，但低劑量組效果最明顯。

一定濃度的尖葉假龍膽提取液能夠提升酒精性肝損傷大鼠肝組織中SOD活力以及GSH含量，從而對肝臟具有保護作用。SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，能夠清除超氧陰離子自由基,保護細胞免受損傷[15]。人們認為自由基(也稱游離基)與絕大部分疾病以及機體的衰老有關。由于自由基非常活潑，化學反應性極強，參與一系列的連鎖反應，能引起細胞生物膜上的脂質過氧化，破壞了膜的結構和功能。并且能引起蛋白質變性和交聯(lián)，使體內(nèi)的許多酶及激素失去生物活性，機體的免疫能力、神經(jīng)反射能力、運動能力等系統(tǒng)活力降低，同時還能破壞核酸結構和導致整個機體代謝失常等，最終使機體發(fā)生病變。因此，自由基作為機體垃圾，能夠促使某些疾病的發(fā)生和機體的衰老。雖然自由基會對機體產(chǎn)生諸多危害，但是在一般的條件下機體細胞內(nèi)也存在著清除自由基、抑制自由基反應的體系，有的屬于抗氧化酶類，有的屬于抗氧化劑。SOD就是一種主要的抗氧化酶，能清除超氧化物自由基，在防御氧的毒性、抑制老年疾病以及預防衰老等方面起著重要作用。SOD能專一地清除體內(nèi)有害的自由基，以解除自由基氧化體內(nèi)的某些組成成分而造成的機體損害。GSH是一種低分子清除劑，它可清除O2、H2O2、LOOH(過氧化脂)。GSH是谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的一種三肽，是組織中主要的非蛋白質的巰基化合物，并且是GSH-Px和GST兩種酶類的底物，為這二種酶分解氫過氧化物所必需，能穩(wěn)定含巰基的酶和防止血紅蛋白及其他輔因子受氧化損傷，GSH量的多少是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素。酒精性肝損傷進展過程中,會產(chǎn)生大量的氧自由基，氧自由基會對機體造成氧化損傷，同時大量的氧自由基作用于脂質，使其發(fā)生氧化反應最終生成MDA,后者會引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，對細胞具有毒性作用，會加劇膜的損傷。實驗組大鼠應用尖葉假龍膽后抗氧化損傷能力明顯增強，肝組織中SOD水平明顯升高，高劑量組血清中GSH含量也上升明顯，這些改變均有助于減輕大鼠因飲酒導致的肝臟氧化損傷。

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